论文摘要
目的;用原代培养的大鼠海马神经细胞,制造缺血再灌注凋亡模型,观察异丙酚对凋亡过程中不同时间点胞浆内细胞色素C释放含量变化的影响,探讨异丙酚在神经细胞凋亡进程中的保护作用机制。方法;1.孕18天大鼠胎鼠,分离海马,切碎后经0.125%（1.25g/L）胰蛋白酶消化得到细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,进行海马神经细胞原代培养。相差显微镜下观察细胞生长情况。2.采用低糖无氧培养即营养剥夺模型,获得脑缺血缺氧凋亡模型。将培养细胞更换含10%胎牛血清的低糖DMEM/F12培养液,置入缺氧培养箱培养6小时,再更换为原含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,复氧培养24小时。3.分组及给药方法;将培养7～9天的胎鼠海马细胞预先进行细胞计数保证各瓶细胞数量达5*108cells/L。三瓶一组,随机分为正常对照组（C组）——正常培养,不施加缺血缺氧培养;模型组（M组）——缺血缺氧及复氧过程中不加异丙酚;异丙酚Ⅰ组,于缺氧前向培养液中加入先前配置的异丙酚溶液至培养液中异丙酚终浓度为200μM和20μM（Ⅰ1和Ⅰ2）;异丙酚Ⅱ组于缺氧6h后复氧开始前以同样方法加入异丙酚溶液至培养液中异丙酚终浓度分别为200μM和20μM（Ⅱ1和Ⅱ2）。异丙酚Ⅲ组于复氧后2h加入异丙酚溶液至培养液中异丙酚终浓度为200μM。4.分别对各组取缺氧前（T0）、缺氧完毕（T1）、复氧2小时（T2）、复氧24小时（T3）样本,光镜下观察细胞形态学变化,测定胞浆内所含细胞色素C的浓度。5.对所得数据进行统计学分析。使用单因素方差分析和LSD检验,P＜0.05为有显著性差异。结果;1.光镜观察;正常对照组（C组）神经元在常氧条件下继续培养24小时后,神经元形态及存活数无明显变化;模型组（M组）缺氧6小时,细胞开始出现形态改变,部分神经元胞体肿胀增大;复氧两小时,细胞较多出现凋亡期形态变化,胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩,凋亡小体形成;至复氧24小时,凋亡细胞数量明显增多,存活细胞数量少;异丙酚各组同时间点细胞形态较模型组（M组）有明显改善,细胞形态变化不明显,凋亡细胞数目明显减少。大剂量组差异更明显。Ⅰ1甚至与正常对照组（C组）相近。各异丙酚组间24小时（T3）点细胞形态及存活数量差异不明显。2.胞浆内细胞色素C浓度变化;1)正常对照组（C组）;神经元胞浆内细胞色素C在T1及T2时间点较T0点无明显增加,T3点测定值较T0点有增加趋势,但无显著性差异（P＞0.05）;2)模型组（M组）;与缺氧前（T0）对比,模型组（M组）缺氧结束（T1）和复氧2小时（T2）细胞色素C均有增高（P＜0.05）,且T2较T1时间点持续增高（P＜0.05）。M组T1、T2、T3时间点与C组间比较细胞色素C浓度皆有增加,且差异显著（P＜0.05）;3)异丙酚组;与对照组（C组）比较,缺氧完毕（T1）、复氧2小时（T2）时间。点Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅲ组也有细胞色素C浓度升高,且差异显著（P＜0.05）,Ⅰ1组与C组T2点无显著性差别（P＞0.05）;24小时（T3）点各异丙酚组与正常对照组（C组）比较则无显著差异（P＞0.05）;4)异丙酚各组浓度与模型组（M组）比较;缺氧完毕（T1）、复氧2小时（T2）、复氧24小时（T3）时间点皆有显著降低,LSD检验显示有显著性差异（P＜0.05）;5)各异丙酚组;与基础测定值对比,缺氧完毕（T1）、复氧2小时（T2）、复氧24小时（T3）时间点细胞色素C浓度呈增加趋势。6)异丙酚组组间比较;异丙酚Ⅰ组在缺氧完毕（T1）、复氧2小时（T2）时间点的细胞色素C值低于异丙酚Ⅱ、Ⅲ组,差异显著（P＜0.05）。24小时（T3）点各组则无显著差异（P＞0.05）。异丙酚Ⅲ组与Ⅱ1组对比,复氧2小时（T2）差异显著（P＜0.05）,复氧24小时（T3）无显著差异（P＞0.05）;与Ⅱ2组对比,复氧2小时（T2）、复氧24小时（T3）时间点无显著差异（P＞0.05）。7)不同剂量异丙酚组对比;大剂量（Ⅰ1、Ⅱ1）组在复氧2小时（T2）时间点与小剂量组（Ⅰ2、Ⅱ2）比较差异显著（P＜0.05）,LSD检验显示大剂量（Ⅰ1、Ⅱ1）组胞浆细胞色素C值低于小剂量（Ⅰ2、Ⅱ2）组;缺氧完毕（T1）及24小时（T3）点大小剂量组则无显著差异（P＞0.05）。