葡萄卷叶伴随病毒-2 CP基因转化本氏烟的初步研究

论文摘要

由葡萄卷叶伴随病毒（Grapevine leafroll-associated virus,GLRaVs）引起的葡萄卷叶病在我国葡萄产地发生普遍,染病葡萄产量明显下降,品质降低,严重影响着葡萄产业的发展。近年来在一些作物上通过导入病毒外壳蛋白（CP）基因成功获得抗病毒材料,这种策略为这类病害的防治开辟了新的途径。本研究通过构建GLRaV-2 CP基因的植物表达载体,采用叶盘法通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105转化本氏烟（Nicotiana benthamiana）,得到了转化GLRaV-2 CP基因的植株。主要研究结果如下:1、构建了GLRaV-2 CP基因正义链的植物表达载体:在引物5′端设计了XbaⅠ,3′端设计了SmaⅠ酶切位点,合成新的引物CP2-F/CP2-R重新扩增GLRaV-2 CP基因,然后将GLRaV-2 CP基因连接植物表达载体pCAMBIA1301S,转化E.coli菌株DH10B感受态细胞,经过PCR和双酶切（XbaⅠ和SmaⅠ）筛选阳性克隆,成功构建了GLRaV-2 CP基因正义链植物表达载体。2、成功将GLRaV-2 CP基因转化了烟草:将pCAMBIA1301S质粒和成功构建的GLRaV-2 CP基因正义链植物表达载体质粒及本实验室前期获得的GLRaV-2 CP基因反义链植物表达载体质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105感受态细胞,采用农杆菌介导的叶盘法转化本氏烟叶盘。通过共培养、选择诱导培养和生根培养,获得119株转化植株,其中转GLRaV-2 CP基因正义链58株,转GLRaV-2 CP基因反义链35株,转pCAMBIA1301S质粒26株,幼芽分化率达80%以上。采用CTAB法小量提取转基因植株的总DNA,利用相应的特异引物进行PCR鉴定,结果检测阳性率均在80%以上。3、建立了转基因烟草扩繁、生根和移栽体系。采用叶盘法,分别对GLRaV-2CP基因、pCAMBIA1301S质粒和本实验室前期获得的GLRaV-2 RdRp基因的转化植株进行幼芽扩繁,结果每个叶盘可平均分化出幼芽近50个。将分化的幼芽再转入3种生根培养基上进行诱导生根培养,结果表明MS+IBA 0.1mg/L培养基的生根效果最佳,生根率达100%。将生根的植株移栽到温室内的花盆中,移栽成活率均在70%以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 葡萄卷叶病研究
• 1.1 葡萄卷叶病的发现
• 1.2 葡萄卷叶病症状表现、寄主范围及其传播方式
• 1.3 葡萄卷叶病的病原和伴随病毒-2（GLRaV-2）
• 2 植物基因工程研究
• 2.1 植物转基因研究
• 2.2 植物抗病毒基因工程研究
• 2.2.1 外壳蛋白抗病毒基因工程
• 2.2.2 复制酶抗病毒基因工程
• 2.2.3 反义RNA技术抗病毒基因工程
• 3 葡萄遗传转化研究进展
• 4 植物组织培养技术发展概述
• 4.1 植物组织培养理论起源
• 4.2 植物组织培养基本培养基的研究
• 4.3 植物生长调节物质在组织培养中的地位与作用
• 5 研究目的及意义
• 第二章 GLRaV-2 CP基因正义链植物表达载体的构建
• 1 主要试剂与材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 供试材料
• 2 方法
• 2.1 抽提质粒
• 2.2 引物设计
• 2.3 GLRaV-2 CP基因的PCR扩增与检测
• 2.4 目标片段的回收与纯化
• 2.5 连接
• 2.6 连接产物转化宿主菌DH10B感受态细胞
• 2.6.1 大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备
• 2.6.2 转化
• 2.7 阳性克隆的筛选
• 2.8 抽提重组质粒和酶切鉴定
• 2.9 GLRaV-2 CP基因正义链的植物表达载体构建
• 3 结果与分析
• 3.1 GLRaV-2 CP基因的克隆
• 3.2 GLRaV-2 CP基因正义链的植物表达载体构建
• 第三章 GLRaV-2 CP基因转化烟草研究
• 1 主要试剂与材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 供试材料
• 2 方法
• 2.1 本氏烟无菌实生苗的培育
• 2.2 植物表达载体转化农杆菌
• 2.2.1 农杆菌EHA105电转感受态细胞制备
• 2.2.2 转化农杆菌
• 2.3 单克隆的PCR检测
• 2.4 农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草
• 2.4.1 制备侵染液
• 2.4.2 侵染液侵染叶盘
• 2.4.3 共培养
• 2.4.4 选择诱导培养
• 2.5 转基因植株的PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体转化农杆菌感受态细胞
• 3.2 农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草
• 3.2.1 侵染液侵染叶盘和共培养
• 3.2.2 选择诱导培养
• 3.3 转基因植株的PCR检测
• 第四章 转基因植株的扩繁、生根和移栽
• 1 主要试剂与材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 供试材料
• 2 方法
• 2.1 转基因植株的扩繁
• 2.2 转基因植株的生根
• 2.3 转基因植株的移栽
• 3 结果与分析
• 3.1 叶盘法扩繁幼芽分化情况
• 3.2 最佳生根条件
• 3.3 转基因植株的移栽成活率
• 第五章 结论与讨论
• 附录 试验常用溶液配方
• 参考文献
• 致谢