二甲双胍对2型糖尿病合并结直肠癌患者预后的影响及其机制

论文摘要

[背景]目前,我国糖尿病的发病率已经达到9.7%,究其原因,主要是由于人民生活水平的提高,生活方式的迅速改变,进而导致糖尿病的发病率也快速增长。糖尿病除了引起血管及神经系统并发症外,与恶性肿瘤的发生、发展也密切相关。研究显示,2型糖尿病患者发生结直肠癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的风险显著高于一般人群。糖尿病已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。二甲双胍作为一种胰岛素增敏剂,已经广泛应用于2型糖尿病患者的治疗。临床研究显示二甲双胍对肿瘤患者具有一定的保护作用。使用二甲双胍降糖治疗的2型糖尿病患者恶性肿瘤发生的风险性与使用磺脲类降糖药物的患者相比下降了23%,并且肿瘤相关死亡率也显著降低。Diabetologia上的一项队列研究显示,胰岛素或胰岛素促泌剂的治疗与恶性肿瘤风险的增加相关,联用二甲双胍能使其增加的风险显著降低。二甲双胍的应用与糖尿病患者结直肠癌的发生、发展密切相关。Zhang ZL等通过对108161名2型糖尿病患者的荟萃分析发现,使用二甲双胍治疗可以显著降低结直肠癌的发病率。Lee JH等经过41个月的随访观察发现,患有结直肠癌的糖尿病患者,在结肠癌术后口服二甲双胍与其它降糖方案相比,总的死亡率及结直肠癌相关的死亡率均显著降低。Lee MS等通过队列研究发现2型糖尿病患者结肠癌的发病率是非糖尿病患者的2倍,而口服二甲双胍的糖尿病患者结肠癌的发病率与非糖尿病患者一致。Hosono K等通过临床研究发现,结肠镜检有结肠变性隐窝病灶（癌前病变）的患者口服二甲双胍（250mg/d）1个月后,病灶数目显著减少,同时肠上皮细胞的增殖能力也显著降低。关于二甲双胍抗癌作用的机制尚不完全清楚,目前的研究多认为与其发挥降糖作用的机制相关。一系列的研究显示,2型糖尿病患者的高血糖及高胰岛素血症状态导致其发生恶性肿瘤的风险性显著高于一般人群。口服二甲双胍可以降低2型糖尿病患者机体内的胰岛素抵抗、改善高胰岛素血症,从而达到抑制肿瘤发生和发展的目的。近年来,体外实验证实二甲双胍可以抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡,其本身存在着直接的抗肿瘤活性。二甲双胍可以有效激活AMP活化的蛋白激酶（AMPK）及其下游通路,使肝脏糖异生减少,同时增加外周组织对糖的摄取和利用,进而降低血糖。AMP与人体内的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、p53/p21途径、mTOR通路、脂肪酸代谢相关通路、蛋白质代谢相关通路等多种信号传导通路相关。AMPK的活化可以阻断细胞内蛋白质的合成,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。近来,许多研究显示,二甲双胍具有杀伤肿瘤干细胞的作用。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体,均具有自我更新能力和不定向分化潜能,可以导致肿瘤的发生。现认为肿瘤干细胞是肿瘤形成及其不断生长的根源。Vazquez等研究发现,二甲双胍通过降低主要驱动因子（转录因子ZEB1、TWIST1、SNA12）的表达,抑制上皮间质转化（EMT）,从而减少乳腺癌肿瘤干细胞的产生。Soritau等通过对III和IV期多形性胶质母细胞瘤患者的手术标本进行组织培养,从中提取的肿瘤细胞具有干细胞的特征,该细胞对常规的化疗药物替莫唑胺（TMZ）耐药,而替莫唑胺合用二甲双胍较单独使用替莫唑胺对肿瘤细胞的抑制率明显增加。Lliopoulos等通过动物实验发现,一定剂量的阿霉素可以抑制裸鼠体内移植的肿瘤组织（包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌）的生长和复发,而合用二甲双胍后原剂量1/4的阿霉素对肿瘤组织的抑制效果与之前的剂量相比,无明显差异,考虑是由于二甲双胍能够特异性杀伤对化疗药物阿霉素耐药的肿瘤干细胞。Oliveras等发现二甲双胍可以使乳腺癌细胞MCF-7中抑癌基因let-7a的表达增加18倍,阻碍TGFβ引起的原癌基因181a表达的增加,从而阻滞EMT相关的乳腺癌细胞的自我更新。二甲双胍降低乳腺癌组织内肿瘤干细胞标志CD24的表达,而CD24可以促进肿瘤细胞的转移。卵巢癌及肺癌的研究提示：二甲双胍在抑制肿瘤组织生长、血管生成及转移方面与化疗药物顺铂具有协同作用。5-氟尿嘧啶（5-FU）是结直肠癌的常规化疗药物,由于它疗效确切,一直处于其他化疗药无法替代的地位,但一些结直肠癌病例对5-FU为主的化疗并不敏感,其对5-FU单药治疗的有效率仅为20%。研究发现,对5-FU耐药的细胞多属于肿瘤干细胞群。二甲双胍对结直肠癌干细胞是否具有特异性杀伤作用,与结直肠癌的常规化疗药物5-FU之间是否具有协同作用,能否改善5-FU耐药,降低5-FU的使用剂量,尚未见相关文献报道。CD133是结直肠癌干细胞标志之一。2007年,O’Brien CA等在裸鼠体内运用肾被膜移植实验鉴定了人类直肠癌的起始细胞（CC-IC）。纯化实验证实所有的CC-ICs均为CD133+细胞,CD133-细胞组成肿瘤的主要部分但不能促进肿瘤生长。通过有限稀释法发现：CD133+细胞中起始细胞的含量是整个肿瘤细胞中起始细胞含量的200倍。在CD133+细胞群中的CC-ICs在连续的移植中能维持生长、分化以及重建肿瘤的异质性。Wnt/β-catenin信号通路与多种恶性肿瘤的发生发展以及肿瘤细胞耐药性的产生密切相关。肿瘤干细胞内,Wnt/β-catenin通路活化,细胞内β-catenin蛋白表达增加。Wnt/β-catenin通路主要由细胞外因子（Wnt）、跨膜受体（frizzled）、胞质蛋白（β-catenin）及核内转录因子（TCF）等一系列蛋白组成。细胞外因子与受体结合后,通过一系列胞质蛋白间的相互作用,使得细胞浆内β-catenin蛋白含量增加,进入细胞核,与细胞核内的转录因子TCF结合,两者共同作用激活一系列的下游靶基因,包括cylinD1、c-myc等的转录,这些靶基因多数是与细胞增殖及凋亡相关的基因。结肠癌组织中,CD133阳性表达和Wnt/β-catenin通路激活提示肿瘤细胞耐药,预后不良,可以作为肿瘤干细胞的标记。在成骨细胞的研究中发现,二甲双胍能够促进(3-catenin蛋白的磷酸化降解,降低细胞内β-catenin蛋白的水平,进而抑制Wnt/β-catenin通路活性。患有结直肠癌的糖尿病患者,在结直肠癌术后口服二甲双胍与其它降糖方案相比,总的死亡率及结直肠癌相关的死亡率均显著降低,我们推测,可能与二甲双胍能够特异性的抑制结直肠癌干细胞生长,从而抑制了结直肠癌的复发和转移相关。本实验通过对南方医院2010年1月-2012年6月期间住院的2型糖尿病合并结直肠癌患者的临床资料进行回顾性分析,探讨了2型糖尿病与结直肠癌的关系以及不同降糖方案对结直肠癌分化程度以及转移的影响；免疫组化检测了使用二甲双胍降糖的2型糖尿病合并结直肠癌患者与未使用二甲双胍的患者相比,手术切除的结直肠癌肿瘤组织内CD133及β-catenin蛋白表达的差异,探讨了二甲双胍是否对结直肠癌干细胞也具有一定的杀伤作用；细胞学实验检测了二甲双胍预处理能否够增强常规化疗药物5-FU对结肠癌细胞SW620的抑制作用及其可能机制,从而为二甲双胍应用于结直肠癌的预防和治疗提供一定的理论依据。具体研究内容分为以下三部分：第一章2型糖尿病合并结直肠癌患者的临床特点[目的]探讨2型糖尿病合并结直肠癌患者的临床病理特征及降糖药物二甲双胍对肿瘤分化程度及转移的影响。[方法]1.采用统一的调查表,记录南方医院2010-1-1至2012-6-30期间住院治疗的病案资料齐全的2型糖尿病合并结直肠癌患者的临床资料,病例共计187例,其中男性患者107例,女性患者80例。2.调查表的主要内容包括：性别、年龄、2型糖尿病病程、体重指数（BMI）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHOL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、降糖药的使用情况,结直肠癌病理分级、结直肠癌淋巴结及远处转移情况等。3.采用SPSS16.0统计软件对实验结果及临床资料进行统计分析,总结结肠癌合并糖尿病患者的临床特点,计量资料用x±sd表示,两组间均数比较采用t检验；计数资料用百分数（%）表示,采用X2检验；P<0.05为差异具有统计学意义。[结果]1.187例2型糖尿病合并结直肠癌患者的平均年龄为63.24±11.29岁,平均糖尿病病程为5.25±5.36年,发现结肠癌时才诊断糖尿病的患者占47.06%,患者临床计量资料的单样本t检验显示,除外FBG和HbA1c外,患者的其它资料基本在正常范围内（95%可信区间）。2.患者结直肠癌的病理类型以中分化腺癌为主,占51.34%,其次为高分腺癌（26.20%）,低分化腺癌（7.9%）,粘液腺癌（10.70%）。其它病理类型分别为：印戒细胞癌1例；管状绒毛状腺瘤,伴局部癌变1例；病理类型不详伴广泛转移4例。3.患者淋巴结转移率为25.67%；肝转移16例（8.56%）；肺转移5例（2.67%）；腹腔转移5例（2.67%）；盆腔转移2例（1.07%）；膀胱侵犯2例（1.07%）。4.按照降糖药物的使用情况,将患者分为二甲双胍组和非二甲双胍组,二甲双胍组患者低分化腺癌比例及远处转移率均显著低于非二甲双胍组,提示二甲双胍组患者结直肠癌的预后较好。[结论]1.2型糖尿病合并结直肠癌患者,占同期南方医院住院的结直肠癌患者的12.74%,其中,高达47.06%的患者是在已经诊断结直肠癌的基础上,入院常规检查时才诊断了2型糖尿病,与我国糖尿病患病率高、检出率低的现状是相符合的。患者空腹血糖的平均水平为（9.27±2.58）mmol/L,糖化血红蛋白的平均水平为（7.25±1.65）%,血糖控制差,不利于肿瘤的治疗。2.研究中的187例2型糖尿病合并结直肠癌患者,初诊结直肠癌时已经合并远处转移者为29例,占15.51%,远处转移率高,预后差；3.二甲双胍组与非二甲双胍组患者相比,二甲双胍组患者结直肠癌中低分化腺癌比例、远处转移率均低于非二甲双胍组,提示二甲双胍组患者结直肠癌的预后较好。第二章二甲双胍对结直肠癌组织中CD133及β-catenin蛋白表达的影响[目的]初步探讨二甲双胍对结肠癌组织中复发和转移相关的蛋白质CD133及β-catenin表达的影响。[方法]1.以2010年1月至2012年6月南方医院普外科住院的2型糖尿病合并结肠癌患者手术切除的肿瘤组织为研究对象,其中二甲双胍组19例（组织病理分级为：高分化者3例,中分化者15例,低分化者1例）,非二甲双胍组18例（组织病理分级为：高分化者4例,中分化者11例,低分化者3例）。2.免疫组织化学方法观察两组标本中CD133及β-catenin蛋白表达的差异。3.采用SPSS16.0统计软件包进行χ2检验,P<0.05为差异具有统计学意义。[结果]1.二甲双胍组患者结直肠癌组织中CD133蛋白阳性表达率为21.1%（4/19）,非二甲双胍组阳性表达率为50%（9/18）。非二甲双胍组CD133阳性表达率高于二甲双胍组,但是差异无统计学意义（P=0.065）。2.二甲双胍组患者结直肠癌组织中β-catenin蛋白阳性表达率为36.8%（7/19）,非二甲双胍组阳性表达率为72.2%（13/18）,两组间差异具有统计学意义（P=0.031）。[结论]1.二甲双胍组与非二甲双胍组患者相比,二甲双胍组患者结直肠癌组织中CD133及β-catenin蛋白的阳性表达率均低于非二甲双胍组,可能是二甲双胍改善结直肠癌患者预后的机制之一。2.术前未进行放化疗的2型糖尿病合并结直肠癌患者手术标本数量有限,本研究具有一定的局限性,有待进一步扩大样本量深入探讨。第三章二甲双胍预处理对5-氟尿嘧啶抑制人结肠癌细胞SW620增殖的影响及其机制[目的]初步探讨二甲双胍预处理能否增强化疗药物5-FU对人结肠癌细胞SW620的抑制作用及其可能机制。[方法]1.以人结肠癌株SW620为实验对象。采用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内。2.实验分组：（1）正常对照组（未加药物处理的人结肠癌细胞SW620）；（2）5-FU干预SW620细胞组,以下简称5-FU组：用含有25mg/ml5-FU的RPMI1640完全培养基培养细胞48小时；（3）二甲双胍预处理SW620细胞组,以下简称MET+5-FU组：用二甲双胍（5mmol/L）预处理24h后,再用含有25mg/ml5-FU的RPMI1640完全培养基培养细胞48小时。3.MTT法测定各组细胞的增殖能力。4.流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡以及CD133+细胞比例。5.免疫印迹法（Western Blot）检测各组细胞总蛋白及细胞核蛋白内β-catenin蛋白的表达水平。6.采用SPSS16.0统计软件进行处理,各指标数据采用均数±标准差（x±sd）表示,各组均数比较采用方差分析,方差齐时,多重比较采用LSD法（Least-significant difference test）检测,方差不齐时,多重比较采用Tambane’sT2法检测。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1.二甲双胍预处理增强5-FU对细胞增殖的抑制作用MTT法观察三种细胞的增殖情况：24h,5-FU组细胞的OD值与MET+5-FU组相比差异没有统计学意义；48h和72h,5-FU组细胞的OD值低于MET+5-FU组,两组间的差异具有统计学意义（P<0.05）。2.二甲双胍预处理降低细胞周期S期细胞比例正常对照组、5-FU组、MET+5-FU组细胞周期S期细胞比例分别为（43.06±2.75）%；（39.62±0.88）%；（24.14±6.01）%,三组细胞间的差异具有统计学意义（F=20.562,P=0.002）,MET+5-FU组S期细胞比例显著低于5-FU组（P=0.003）。3.二甲双胍预处理增强5-FU促进细胞凋亡的作用（1）正常对照组、5-FU组、MET+5-FU组细胞早期凋亡率分别为（1.333±0.351）%,（1.767±0.611）%,（3.500±1.082）%,三组细胞早期凋亡率的差异具有统计学意义（F=7.098,P=0.026）,SW620组与5-FU组相比差异不具有统计学意义（P=0.503）,5-FU组与MET+5-FU组相比具有显著差异（P=0.029）；（2）正常对照组、5-FU组、MET+5-FU组细胞晚期凋亡率分别为（3.667±0.252）%,（9.467±2.003）%,（18.233±1.159）%,三组细胞晚期凋亡率的差异具有统计学意义（F=81.728,P=0.006）,各组间的差异均具有统计学意义（P<0.05）。4.二甲双胍预处理降低细胞内CD133+细胞比例正常对照组、5-FU组、MET+5-FU组细胞内CD133+细胞比例分别为（27.63±2.58）%,（21.30±1.40）%,（15.13±3.43）%,三组细胞间CD133+细胞比例的差异具有统计学意义（F=17.254,P=0.003）,各组间的差异均具有统计学意义（P<0.05）。5.二甲双胍预处理降低细胞总蛋白及细胞核蛋白内β-catenin蛋白含量（1）正常对照组、5-FU组、MET+5-FU组细胞总蛋白内β-catenin蛋白的相对表达量分别为0.936±0.005,0.884±0.017,0.463±0.061,三组细胞总蛋白中β-catenin蛋白表达量的差异具有统计学意义（F=82.531,P=0.000）；（2）正常对照组、5-FU组、MET+5-FU组细胞核蛋白内β-catenin蛋白的相对表达量分别为1.890±0.242,1.760±0.342,1.163±0.242,三组细胞核蛋白中β-catenin蛋白表达量的差异具有统计学意义（F=5.774,P=0.040）；（3） MET+5-FU组细胞总蛋白及细胞核蛋白内β-catenin蛋白的表达均显著低于5-FU组（P<0.05）,5-FU组与SW620组之间的差异均不具有统计学意义（P>0.05）。[结论]1.二甲双胍预处理增强了5-FU对结肠癌细胞SW620增殖的抑制作用,细胞周期S期细胞比例显著降低,细胞凋亡率增加。2.二甲双胍预处理增强了5-FU对结肠癌细胞SW620中CD133+细胞的杀伤作用,抑制了细胞内Wnt/β-catenin通路活性。3.二甲双胍与结直肠癌常规化疗药物5-FU具有协同作用,这可能是术后口服二甲双胍降糖的2型糖尿病合并结直肠癌患者肿瘤相关死亡率降低的原因之一,二甲双胍有可能作为一种新的辅助治疗药物,提高结直肠癌患者对5-FU的敏感性,改善化疗效果,降低5-FU的使用剂量,减少对其对正常细胞的损害。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 2型糖尿病合并结直肠癌患者的临床特点
• 第1节 对象与方法
• 第2节 结果
• 第3节 讨论
• 第4节 小结
• 第二章 二甲双胍对结直肠癌组织中CD133及p-catenin蛋白表达的影响
• 第1节 材料与方法
• 第2节 结果
• 第3节 讨论
• 第4节 小结
• 第三章 二甲双胍预处理对5-氟尿嘧啶抑制人结肠癌细胞SW620增殖的影响及其机制
• 第1节 材料和方法
• 第2节 结果
• 第3节 讨论
• 第4节 小结
• 全文小结
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 统计学证明