白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒5’-核苷酸酶分离纯化、理化性质及抑制家兔血小板聚集机制研究

论文摘要

白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）是蝮亚科（Crotalinae）竹叶青属（Trimeresurus）的一种剧毒毒蛇,主要分布于重庆、四川、云南、贵州、福建、广东、广西、海南和台湾等地区。我们实验室对从重庆金釜山采集的白唇竹叶青蛇毒进行初步研究首次发现,该蛇毒对血小板的聚集有抑制作用,并采用Jesudium等（1976）的方法测得粗毒中含有5’-核苷酸酶活性。5’-核苷酸酶是一种磷酸酯酶,主要分布于动植物细胞、细菌及动物毒液中。它能水解5’-单核苷酸,产生核苷,作为一种工具酶,已被广泛用于基因工程和核酸研究。同时,该酶也具有重要的生物功能,如在细胞生长发育、运动、纤维蛋白合成、神经传递、提高表皮或内皮屏障功能及淋巴细胞的黏附、在血液循环、免疫应答等方面均发挥重要的作用。不同生物来源和同种生物不同组织细胞来源的5’-核苷酸酶的理化、酶学性质和生物功能存在一定的异同（Str?ter, 2006）。尤其是从不同种蛇毒来源的5’-核苷酸酶在生物功能上显示出异同,如从棕点竹叶青（T. gramineus）蛇毒中分离出的5’-核苷酸酶,具有抑制由ADP、花生四烯酸（AA）、胶原蛋白、低浓度凝血酶和Ionophor（A-23187）诱导的血小板聚集的活性;从竹叶青（T. Stejnegeri）蛇毒分离出的5’-核苷酸酶能抑制ADP、AA、TMVA、凝血酶诱导的血小板聚集,而且对ADP诱导的血小板聚集还有明显的解聚作用;Dhananiaya等（2006）报道了眼镜蛇（Naja naja）毒的5’-核苷酸酶具有抗凝血作用。目前,对我国产白唇竹叶青（T. albolabris）蛇毒5’-核苷酸酶的研究还未曾见报道。因此,本研究以我国重庆金釜山地区产的白唇竹叶青蛇为研究对象,从其蛇毒中分离出5’-核苷酸酶,并对其理化性质、酶学性质以及抑制血小板聚集的生物功能进行研究。主要研究工作包括以下几个方面:1白唇竹叶青蛇毒粗毒的采集和制备,粗毒的蛋白含量为81%左右,半致死量LD50为7.01±0.55 mg/kg。检测发现粗毒具有精氨酸酯酶活力0.536μmol /min mg。磷脂酶A2活性1.03μmol / min mg、AMP为底物时5’-核苷酸酶活性为9.02μg Pi/min mg此外碱性磷酸单酯酶8.45μmol /min mg,磷酸二酯酶活力为17.5μmol /min mg。2用DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50三步柱层析分离法,从白唇竹叶青（T. albolabris）蛇毒中分离纯化出具有5’-核苷酸酶活性的组分。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为48.03 kDa,HPLC柱层析图谱为单一峰。未检测到粗毒中具有的精氨酸酯酶、碱性磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及磷脂酶A2活性。它是一个糖蛋白,以AMP为底物时,其酶活力为330.33μg Pi/min mg,而以ADP为底物时,其酶活力为123.56μg Pi/min mg。EDTA可抑制它的酶活性,其最适pH为9,最适温度为50℃。分析表明,在理化和酶学性质方面,白唇竹叶青（T. albolabris）蛇毒5’-核苷酸酶组分与不同生物来源的5’-核苷酸酶存在许多相似之处,也存在一些差异。3该酶能抑制由二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸（AA）、（PAF）诱导的家兔富血小板血浆聚集。抑制率与5’-核苷酸酶的剂量成正比。对洗涤血小板等聚集的抑制作用研究表明白唇竹叶青蛇毒5’-核苷酸酶抑制血小板聚集的作用可能与水解ADP和积累腺苷有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写一览表
• 1 文献综述
• 2 引言
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.2 本研究的主要内容
• 2.3 本研究的技术路线
• 3 白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒粗毒的制备和性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 试验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 4 白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒5’-核苷酸酶的分离纯化及性质
• 4.1 仪器与材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 5 白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）蛇毒5’-核苷酸酶抑制家兔血小板聚集机制研究
• 5.1 仪器与材料
• 5.2 方法
• 5.3 结果
• 6 全文总结
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况
• 致谢