黄粉虫抗菌肽的诱导、生物学活性测定及初步分离纯化

论文摘要

本文通过采用不同的诱导方法对黄粉虫进行诱导,分别采用了紫外线诱导法、超声波诱导法、针刺诱导法、菌液浸泡诱导法、饥饿诱导法、菌液注射诱导法等方法;每种诱导方法分别采用不同剂量或不同的诱导时间,且诱导后分别培养不同的时间,之后取其血淋巴并通过进行抑菌圈试验确定其是否已经产生抗菌活性物质,若产生则观察其抗菌活性的强弱。试验得出在不同的诱导方法中采用菌液注射的方法注射1.0μl/头、诱导后培养48h效果最好;其次为菌液浸泡诱导法和饥饿诱导法;另外几种诱导方式虽有一定的抑菌效果但不显著。本试验中同时对不同诱导方法分别采用了不同的诱导后培养时间,分别为24h、48h、72h。结果发现诱导后培养不同的时间,其血淋巴的抑菌活性也存在很大差异,以48h为最佳;若小于48h,在虫体内并没有完全形成系统有效的防御机制,因而抑菌活性不理想;若大于48h,菌液在虫体内存留太长时间,且菌的繁殖速度很快,以致于大部分供试虫体防御系统的形成速度远远小于菌在体内生长的速度,造成虫体萎靡不振、活动力下降、血淋巴提取量减少,甚至使供试黄粉虫死亡,也不利于观察其抑菌活性。本文首次对多种诱导方法进行了详细比较,从而筛选出较优的诱导方法。以最佳诱导方法诱导后取血淋巴进行抗菌肽生物学活性的测定。分别进行了对热稳定性、反复冻溶的稳定性、蛋白酶稳定性、pH值及有机溶剂对抗菌肽抑菌活性影响的测定。试验结果为:黄粉虫抗菌肽有较好的热稳定性,在90～100℃处理10min后仍有较好的抑菌效果;经反复冻溶后,抑菌圈直径均有一定程度的减小,但冻溶4次以下差异无显著性、冻溶6～10次,抑菌活性与对照相比差异达显著性水平,但仍可观察到抑菌效果;经胰蛋白酶及胃蛋白酶作用后抗菌肽的抑菌率均有所下降,而蛋白酶K对其抑菌活力影响不大;pH值在5.0-9.0范围内,抑菌活性虽有一定程度的下降但均不能造成其抗菌活性的丧失,而在pH＜5或pH＞9的环境条件下抑菌活性会受到很大影响或不表现活性;甲醇、正丁醇对抗菌肽的抑菌活性无显著影响,乙醇、氯仿、异丙醇对抗菌肽的抑菌活性有一定影响。通过以上结果得出结论:黄粉虫抗菌肽具有较好的热稳定性、在低温反复冻融后仍保持有较高的活性、经蛋白酶作用后抗菌肽的抑菌活性有所下降;另外PH值、有机溶剂作用也对抗菌肽的抑菌活性产生或多或少的影响。用凝胶过滤层析分离纯化血淋巴中抗菌肽,以大肠杆菌为指示菌种,抗菌活性测定的结果表明,经Sephadex G50凝胶过滤柱层析分离后得到2个较明显的活性峰,结果显示从收集的第5管至第19管均有抑菌活性,说明收集物是由多种成分混合在一起的,因而说明分离的并不彻底。将Sephadex G50分离后有活性的部分合并在一起,浓缩后经Sephadex G25凝胶过滤柱层析分离得到3个活性峰,表明黄粉幼虫血淋巴中有多个抗菌肽组分。如何分离纯化到单体还有待于进一步研究。本试验是黄粉虫抗菌肽进一步分离纯化研究的基础;并对如何更有效更便捷的诱导黄粉虫使其产生抗菌肽首次进行了详细的比较与筛选,从而确定了一种较优较合理的诱导方法;另外,通过对其生物学特性的研究与分析,为更好的保存及合理的利用和研究黄粉虫抗菌肽提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 历史进程
• 1.2 抗菌肽的应用
• 1.2.1 在临床上的应用
• 1.2.2 在植物转基因工程方面的应用
• 1.2.3 在食品方面的应用
• 1.2.4 在畜牧业上的应用
• 1.2.5 在基因工程上的应用
• 1.3 国内外研究现状
• 1.3.1 昆虫抗菌肽的特殊性质
• 1.3.2 抗菌肽的类型
• 1.3.3 抗菌肽的作用机理
• 1.4 前景与展望
• 1.4.1 临床应用前景
• 1.4.2 药用前景
• 1.4.3 动植物基因工程
• 1.4.4 抗菌肽的研究展望
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 供试菌株
• 2.1.3 仪器和试剂
• 2.1.4 培养基的制备
• 2.1.5 诱导源的制备
• 2.2 抗菌肽的诱导及生物学活性测定
• 2.2.1 供试昆虫的饲养
• 2.2.2 抗菌肽诱导方法的筛选
• 2.2.3 血淋巴的提取
• 2.2.4 抗菌肽活性测定
• 2.2.5 最佳诱导龄期的确定
• 2.2.6 抗菌肽的生物学活性测定
• 2.2.7 抗菌谱的测定
• 2.3 抗菌肽的初步分离纯化
• 2.3.1 SephedexG50装柱
• 2.3.2 柱子的平衡
• 2.3.3 样品的预处理
• 2.3.4 上样及洗脱
• 2.3.5 样品的收集
• 2.3.6 样品的浓缩
• 2.3.7 抗菌活性测定
• 2.3.8 Sephedex G25的具体试验方法
• 3.结果与分析
• 3.1 抗菌肽的诱导及生物学活性测定
• 3.1.1 抗菌肽诱导方法的筛选
• 3.1.2 最佳诱导龄期的确定
• 3.1.3 抗菌肽生物学活性测定
• 3.1.4 抗菌谱的测定
• 3.2 抗菌肽的初步分离纯化
• 3.2.1 黄粉虫抗菌肽组分的粗分离
• 3.2.2 黄粉虫抗菌肽组分的再分离
• 4.结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介