PSP驱动CAPD基因的植物表达载体构建及在果树中的遗传转化研究

论文摘要

我国是一个水果生产大国，栽培面积和产量均雄踞世界前列，但各种检疫性、毁灭性的病害（如柑桔黄龙病、香蕉枯萎病和猕猴桃溃疡病等）时刻威胁和制约着生产的发展。培育抗病品种是解决问题的根本途径，但由于抗性资源缺乏且大部分果树存在高度杂合、倍性复杂、育种周期长等问题，杂交育种等传统的抗病育种手段难以奏效。现代生物技术的飞速发展为果树抗病育种提供了新的途径，它可以获得常规育种难以得到的新类型，从而创造出新种质。迄今为止，绝大部分果树抗病基因工程育种采用的启动子是组成型的花椰菜花叶病毒35S启动子，采用的目的基因是来源于微生物或动物、没有经过密码子优化的抗性基因，安全性、专一性和表达效率存在问题。本试验针对果树上存在的一些韧皮部传导的毁灭性病害（如柑桔黄龙病、香蕉枯萎病等），首先从笋瓜中克隆了一个韧皮部特异性启动子，并根据密码子用法分析结果，重新设计和合成了对这些毁灭性病害有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因，然后构建了多种由不同启动子驱动标记基因或目的基因的植物表达载体，最后利用新构建的植物表达载体在双子叶木本果树柑桔、藤本果树猕猴桃和草本果树草莓上进行了转化研究。主要研究结果如下：（1）、根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白PP2序列设计引物，以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板，用PCR方法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段，把片段克隆入pUCm-T载体后，经蓝白斑筛选、PCR检测和酶切鉴定后，获得了新的重组质粒pUCm-PSP，测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性，推测具有相似的启动子功能。（2）、采用高频密码子分析法，分别对甜橙、温州蜜柑、葡萄柚和柠檬等4种柑桔的蛋白质编码基因序列（CDS）进行了分析，计算出了柑桔同义密码子相对使用频率（RFSC），确定出了4种柑桔的高频率密码子，发现不同种类柑桔偏爱密码子稍有差别，但不同种类柑桔的密码子偏爱性是完全一致的。用同样的方法，对柑桔现有的177个CDS进行了分析，确定出了TAA、GCT、GAT、CTT、AGG、AGA和GTT等7个高频率密码子。将柑桔的密码子使用频率与人、果蝇、酵母和大肠杆菌等不同种类模式生物比较后发现，柑桔密码子的偏爱性与不同种类生物有不同程度的差异；但将柑桔的密码子使用频率与拟南芥、番茄、水稻和尖叶蕉等不同种类的植物相比，发现柑桔密码子的偏爱性与同为双子叶植物的拟南芥、番茄完全一样，而与水稻、尖叶蕉这两种单子叶植物均有较大的差异。分析结果对动物或微生物的基因在柑桔中的表达或柑桔基因在微生物中的表达以及基因克隆时设计引物具有一定指导意义。（3）、根据177个GenBank中登录的柑桔编码蛋白密码子用法的分析结果，优化并重新设计和合成了含柑桔偏爱密码子、对柑桔黄龙病等毁灭性病害有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因（命名为CAPD），克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后，获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。（4）、利用基因重组技术，分别构建了pHZ01（来源于pBI121植物表达载体和pUCm-PSP重组质粒，由PSP驱动GUS报告基因）、pHZ02（来源于pCAMBIA1301植物表达载体和pUCm-PSP重组质粒，由PSP驱动GUSA报告基因）、pHZ03（来源于pCAMBIA1302植物表达载体和pUCm-PSP重组质粒，由PSP驱动GFP报告基因）和pHZ04（来源于pCAMBIA1303植物表达载体和pUCm-PSP重组质粒，由PSP驱动GFP和GUSA融合报告基因）等4个由PSP驱动不同类型报告基因的新植物表达载体。利用细胞感受态法直接将4个原始的和4个新重组的植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌中，为利用转基因技术来研究PSP的功能奠定了基础。（5）、同样利用基因重组技术，分别构建了pHZ05（来源于pBI121植物表达载体和含密码子优化的抗菌肽D基因的pUC19-CAPD克隆载体，由CaMV35S组成型启动子驱动CAPD目的基因）和pHZ06（来源于pHZ05新植物表达载体和pUCm-PSP重组质粒，由PSP驱动CAPD目的基因）2个分别由组成型和韧皮部特异性启动子驱动CAPD抗病基因的新植物表达载体。利用细胞感受态法直接将2个新重组的植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中，为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育果树抗病新种质奠定了基础。（6）、基于转化体系建立所需要的高效再生体系，我们首先针对暗柳橙的不同外植体进行了离体再生研究，以期得到较适合的外植体和培养基配方。在不同梯度浓度6-BA与IBA、NAA组合的15种培养基上，对暗柳橙无菌实生黄化苗的上胚轴不同切段及子叶进行再生分化培养，确定了暗柳橙在遗传转化中较为合适的培养基配方为MT+IBA 0.5mg／L+6-BA 2.5mg／L+蔗糖30g／L+琼脂8g／L。上胚轴切段较其它部位外植体更适于用作遗传转化的受体材料。分别以含新构建的植物表达载体pHZ05或pH06的EHA105农杆菌菌液进行了暗柳橙无菌实生黄化苗的上胚轴的转化研究，在预培养、浸染、共培养之后，采用不同的筛选分化方式，确立了使用仅添加头孢霉素抑制农杆菌生长的培养基，至外植体开始进行分化后再进行抗生素梯度浓度筛选培养的方式。这种筛选方式既有利于转化芽的生长，又可减少抗生素对转化芽的抑制作用，还可以在高浓度抗生素条件下防止非转化芽的逃逸。筛选培养4个月后，得到了一批转基因抗性芽。取其中一部分大芽叶片，提取其基因组DNA，进行多种引物的PCR检测和目的基因PCR产物的测序比较，从10株转pHZ05抗性芽中得到3株转基因植株，从60株转pHZ06抗性芽中得到了11株转基因植株。（7）、以“布鲁诺”实生无菌苗叶片为外植体，首先探讨了叶盘放置方式和暗培养时间对不定芽再生的影响，建立了高效的组培再生体系；然后用根癌农杆菌介导的叶盘法，进行了不同启动子驱动CAPD基因的转化研究，经预培养、浸染、共培养和筛选处理后，获得了若干抗性芽；最后，取其中一部分大芽叶片，提取其基因组DNA，进行多种引物的PCR检测和目的基因PCR产物的测序比较，从60株转pHZ05抗性芽中得到7株转基因植株，从40株转pHZ06抗性芽中得到了12株转基因植株。（8）、采用根癌农杆菌介导法，以草莓主栽品种“丰香”组培苗叶片为外植体，分别进行了由组成型启动子和韧皮部特异启动子驱动密码子优化抗菌肽D基因的转化，经预培养、农杆菌浸染和共培养后，先进行2周不加筛选抗生素的诱芽培养，然后经Kan筛选，获得了若干抗卡那霉素植株。提取部分抗性植株的基因组DNA，进行多种引物的PCR检测和目的基因PCR产物的测序比较，从5株转pHZ05抗性植株中得到1株转基因植株，从65株转pHZ06抗性植株中得到了14株转基因植株。本试验为研究不同启动子在果树中的表达特性和利用基因工程育种手段培育果树抗病新品种提供了扎实的基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 韧皮部特异启动子及其在植物基因工程中的应用
• 1.1 启动子概述
• 1.2 韧皮部特异性启动子的特点
• 1.2.1 表达特点
• 1.2.2 结构特点
• 1.3 韧皮部特异性启动子的分类和介绍
• 1.3.1 植物本身来源的韧皮部特异性启动子
• 1.3.2 植物病毒来源的韧皮部特异性启动子
• 1.3.3 植物病原细菌来源的韧皮部特异性启动子
• 1.4 韧皮部特异性启动子在植物基因工程中的应用
• 2 抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的应用
• 2.1 抗菌肽的产生、分类及结构特点
• 2.2 抗菌肽的作用原理
• 2.3 抗菌肽在植物抗病基因工程中的应用及存在的问题
• 2.3.1 抗菌肽在植物抗病基因工程中的应用
• 2.3.2 存在的问题
• 3 果树遗传转化的技术
• 3.1 果树遗传转化的技术
• 3.1.1 遗传转化的方法
• 3.1.2 用于转化的目的基因
• 3.1.3 转化时所用的受体系统
• 3.1.4 影响农杆菌介导的转化效率的因素
• 3.2 果树遗传转化的优势及问题
• 3.2.1 遗传转化技术在果树品种改良上的优势
• 3.2.2 存在的问题
• 3.3 提高转基因植物中外源基因表达水平的技术
• 3.3.1 启动子及终止子的修饰与改造
• 3.3.2 使用植物偏爱密码子
• 3.3.3 利用信号肽进行蛋白质的定向运输
• 3.3.4 构建含MAR的表达载体
• 3.3.5 降低外源基因的拷贝数
• 3.3.6 建立位点特异的重组体系
• 3.3.7 叶绿体和线粒体转化的应用
• 3.4 果树遗传转化的展望
• 3.4.1 建立高效稳定的转化体系
• 3.4.2 加快果树自身目的基因的分离与克隆
• 3.4.3 开展目的基因在果树体内表达调控规律研究
• 3.4.4 开展果树中组织特异启动子研究
• 4 选题依据及研究内容
• 4.1 选题依据与研究意义
• 4.2 研究内容
• 第二章 笋瓜韧皮部特异启动子PP2-P的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌种和质粒
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 实验中使用的主要溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物总 DNA提取和浓度测定
• 1.2.2 PSP特异引物的 PCR扩增
• 1.2.3 PCR产物的回收纯化
• 1.2.4 回收纯化的产物与载体的连接
• 1.2.5 大肠杆菌 TG1感受态细胞的制备
• 1.2.6 连接产物转化大肠杆菌 TG1感受态细胞
• 1.2.7 阳性克隆的鉴定
• 1.2.8 DNA序列测定
• 1.2.9 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PSP的克隆
• 2.2 PSP的序列及分析
• 第三章 柑桔密码子用法分析及抗菌肽D基因密码子优化合成
• 1 材料和方法
• 1.1 密码子用法分析
• 1.2 抗菌肽 D基因的密码子优化和合成
• 2 结果与分析
• 2.1 不同种类柑桔及柑桔整体高频密码子（HF）的确定
• 2.2 密码子偏爱性比较位
• 2.3 含柑桔偏爱密码子的新抗菌肽 D基因的设计及人工合成
• 3 讨论
• 第四章 几个新植物表达载体的构建及转化农杆菌
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 引物、酶及生化药剂
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 由 PSP驱动 GUS报告基因的重组植物表达载体pHZ01构建
• 2.2 由 PSP驱动 GUSA报告基因的重组植物表达载体 pHZ02构建
• 2.3 由 PSP驱动 GFP报告基因的重组植物表达载体pHZ03构建
• 2.4 由 PSP驱动 GFP和GUSA融合报告基因的重组植物表达载体pHZ04构建
• 2.5 由 CaMV35S驱动 CAPD目的基因的重组植物表达载体pHZ05构建
• 2.6 由 PSP驱动 CAPD目的基因的重组植物表达载体pHZ06构建
• 2.7 重组植物表达载体转化农杆菌
• 3 讨论
• 第五章 新植物表达载体转化柑桔的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 组培再生体系建立
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 农杆菌介导的上胚轴遗传转化
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 组培再生体系建立
• 2.1.1 总体情况
• 2.1.2 外植体再生不定芽或芽点的形态学观察
• 2.1.3 6-BA浓度对再生的影响
• 2.1.4 添加其它生长调节剂对再生的影响
• 2.1.5 不同外植体的再生效率
• 2.1.6 高效再生体系的验证及完整植株的获得
• 2.2 农杆菌介导的上胚轴遗传转化
• 2.2.1 抗性芽的筛选
• 2.2.2 抗性芽的鉴定和转基因植株的获得
• 3 讨论
• 3.1 关于组培再生体系建立
• 3.2 关于柑橘转化时筛选和检测技术
• 3.2.1 基因型的影响
• 3.2.2 筛选的策略
• 3.2.3 转基因植株的鉴定
• 第六章 新植物表达载体转化猕猴桃的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 外植体
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 化学药品和试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 PCR检测引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 高效组培再生体系的建立
• 1.2.2 农杆菌介导的叶盘转化
• 2 结果
• 2.1 猕猴桃离体叶片高效组培再生体系的建立
• 2.1.1 叶盘放置方式对再生的影响
• 2.1.2 暗培养时间对再生的影响
• 2.1.3 高效再生体系的验证
• 2.2 猕猴桃转基因植株的获得
• 2.2.1 抗性芽的筛选
• 2.2.2 抗性芽的鉴定和转基因植株的获得
• 3 讨论
• 3.1 关于猕猴桃组培再生体系
• 3.2 关于猕猴桃转基因时的筛选策略
• 3.3 获得转pHZ05和pHZ06转基因植株的意义
• 第七章 根癌农杆菌介导的新植物表达载体转化草莓研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 外植体
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 化学试剂和药品
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 PCR检测
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的培养
• 1.2.2 受体材料的预培养、农杆菌的浸染及共培养
• 1.2.3 抗性芽的筛选和再生
• 1.2.4 抗性芽的生根及转基因植株获得
• 1.2.5 转基因植株的鉴定
• 2 结果
• 2.1 抗性芽的筛选
• 2.2 抗性植株的鉴定和转基因植株的获得
• 2.2.1 多种引物的 PCR鉴定
• 2.2.2 测序鉴定和转基因植株的获得
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 图版I
• 图版II
• 图版III
• 图版IV
• 图版V
• 附录1 各检测引物扩增出的片段序列
• 附录2 转基因植株 CAPD目的基因引物 PCR产物测序结果
• 附录3 攻博期间承担的科研课题
• 附录4 攻博期间发表的论文和论著