转基因植物中重组人表皮生长因子基因表达分析

论文摘要

人表皮生长因子（hEGF）是一种能促进细胞发生有丝分裂的强烈刺激物,作为上皮细胞的分裂原,可以促进上皮细胞增殖分化,从而加速损伤组织的再生和修复。转基因植物作为药用蛋白生物反应器的研究和开发能够以很低的费用大批量生产外源活性蛋白如动物疫苗、抗体、氨基酸等,可以为人类医学和生命科学研究提供诊断试剂和蛋白质药物,具有产生极大的应用价值和商业价值,成为近年来植物分子生物学研究的热点之一。转基因植物作为表达药用蛋白的反应器,与传统的生产方法相比,具有许多优点。本研究通过PCR鉴定植物表达载体pSH-hEGFS,利用农杆菌介导真空渗透法在叶用莴苣中瞬时表达,分析pSH-hEGFS的表达特征。通过农杆菌介导法将携带内质网滞留信号肽SEKDEL编码序列的重组人表皮生长因子基因（hEGF）导入烟草,分析转基因烟草中重组人表皮生长因子基因表达特征及产物表达量,hEGF基因表达对植株是否产生影响,为研制以转基因植物为生物反应器生产人表皮生长因子等药物奠定了基础。研究结果如下:1、利用农杆菌介导真空渗透法研究植物表达载体pSH-hEGFS（包含报告基因GUS）在叶用莴苣中的瞬时表达情况,结果表明在处理后第4—6天,比色法分析莴苣叶片中GUS蛋白活性可达最高值29.2U/g。2、采用农杆菌介导法,将pSH-hEGFS遗传转化烟草,经抗生素抗性筛选获得抗性植株,通过GUS组织化学染色分析、PCR检测以及RT-PCR分析,证明重组人表皮生长因子基因已整合到烟草基因组中并已表达,成功获得了含有hEGF基因的转基因烟草。3、利用间接法ELISA检测,结果表明转基因烟草中重组人表皮生长因子表达量最高达叶片总可溶蛋白的0.003%。4、通过对转基因烟草植物学性状如株型、叶型、茎叶角度、茎围、节距、花序及花色观测,发现与对照非转基因烟草相比,转基因烟草的这些表型基本没有发生变化,证明hEGF基因表达对植株未产生影响。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 1 表皮生长因子研究进展
• 1.1 表皮生长因子的来源
• 1.2 表皮生长因子的分子结构特征
• 1.3 表皮生长因子的生物学活性及作用机制
• 1.4 表皮生长因子的应用及价值
• 2 转基因植物作为药用蛋白生物反应器研究进展
• 2.1 转基因植物表达外源蛋白的主要方法
• 2.2 转基因植物表达外源生物活性蛋白
• 2.3 转基因植物作为药用蛋白生物反应器的问题与解决方法
• 2.4 转基因植物表达人表皮生长因子研究分析与展望
• 第二部分 转基因烟草中重组人表皮生长因子基因表达分析
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 主要生物化学试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 常用培养基
• 1.6 常用溶液
• 2 实验方法
• 2.1 植物表达载体pSH—hEGFS鉴定
• 2.2 植物瞬时表达分析
• 2.3 烟草遗传转化
• 2.4 再生植株的检测
• 3 结果分析
• 3.1 植物表达载体pSH—hEGFS鉴定
• 3.2 植物瞬时表达分析
• 3.3 烟草遗传转化及抗性植株的获得
• 3.4 抗性植株的GUS组织化学染色
• 3.5 抗性植株的PCR检测
• 3.6 转基因植株的RT-PCR检测
• 3.7 ELISA间接法检测转基因植株中重组人表皮生长因子表达量
• 3.8 转基因烟草植物学性状观察
• 4 讨论
• 4.1 重组人表皮生长因子基因表达分析
• 4.2 瞬时表达系统
• 4.3 重组蛋白亚细胞定位
• 4.4 间接法ELISA检测中的问题
• 参考文献
• 图版
• 附录
• 致谢