黄牛Myf5、Pax7基因的克隆、多态性检测及其遗传效应分析

论文摘要

肌肉卫星细胞作为生肌性前体细胞的主要来源,对机体出生后骨骼肌的生长、再生、修复起到至关重要的作用。配对盒基因7（paired box 7,Pax7）是卫星细胞表达的标志性基因,可以通过调控肌细胞生成因子5（myogenic factor 5, Myf5）和肌细胞决定因子（myogenic determination factor, MyoD）,决定卫星细胞的增殖与分化,从而影响机体的生长发育。本研究选择Myf5和Pax7为候选基因,利用Over-lap、DNA测序等方法克隆得到Myf5基因CDS区并进行原核及真核表达,为黄牛转基因研究提供基础资料。另外,采用DNA池测序、PCR-RFLP技术检测了南阳牛、郏县红牛、秦川牛、鲁西牛和草原红牛5个群体共1226个个体的Pax7基因多态性,探讨多态位点在不同群体中的遗传结构、遗传多样性及其与生长性状的关联,以期发现对黄牛生长发育呈正效应的分子标记,为今后黄牛分子标记辅助选择、优质高产新品种或品系培育提供科学依据。本研究获得以下结果:1.黄牛Myf5基因CDS区克隆与表达研究利用Over-lap法（外显子拼接）从秦川牛基因组DNA中克隆得到Myf5基因CDS区,构建pET-28a-Myf5重组载体并转化至大肠杆菌BL21 （DE3） pLysS中,1mmol/L IPTG、37℃条件下诱导表达融合蛋白6×His-Myf5,经SDS-PAGE检测,诱导5h蛋白表达量较大。此外,还成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-Myf5,通过脂质体转染重组质粒pEGFP-C1-Myf5于PK15细胞中,24h后在荧光显微镜下观察转染效率,进一步用Western blot验证Myf5基因在细胞内得到了成功表达。2.黄牛Pax7基因多态性检测及群体遗传学分析利用DNA池测序和PCR-RFLP技术系统检测了黄牛Pax7基因所有编码区和部分内含子区共9个基因座（P1-P9）在5个黄牛群体（南阳牛、郏县红牛、秦川牛、鲁西牛和草原红牛）中的遗传变异。试验中共检测到5个SNPs:NC007300: g.332 ins/del G, g.3531G>A, g.56626G>A, g.66117C>T和g.66251A>G,分别位于Pax7基因的内含子1、外显子3、外显子5、外显子7和内含子7。其中,外显子上的SNPs没有引起氨基酸的改变,属于同义突变。有趣的是,这5处突变位点均发生在某个特定的限制性内切酶识别位点上,可以分别通过EcoRII、HinfI、BspT104I、PstI和ApaI-RFLP方法直接检测。群体遗传学分析显示,g.332 ins/del G位点在五个黄牛群体中检测到AG和GG两种基因型,GG型在五个群体中均为优势基因型,频率在0.6520.983之间;g.3531G>A位点共检测到AA、AG和GG三种基因型,GG型在南阳牛、郏县红牛、秦川牛和鲁西牛群体中为优势基因型,频率在0.5540.724之间;g.56626G>A位点共检测到AA、AG和GG三种基因型,GG型在上述四个牛品种中为优势基因型,频率在0.3870.492之间;g.66117C>T位点共检测到TT、TC和CC三种基因型,CC型在南阳牛、郏县红牛、秦川牛和草原红牛群体中均为优势基因型,频率在0.0.4010.991之间;g.66251A>G位点共检测到AA、AG和GG三种基因型,GG型在南阳牛、郏县红牛、秦川牛和鲁西牛群体中为优势基因型,频率在0.5900.676之间。g.332 ins/del G位点在五个黄牛群体内均处于低度多态（PIC<0.25）,其他四个位点除了g.3531G>A在郏县红牛中处于低度多态外,其余均处于中度多态（0.25<PIC<0.50）;5个多态位点的不同基因型分布在南阳牛与草原红牛、郏县红牛与草原红牛、秦川牛与草原红牛和鲁西牛与草原红牛间均表现极显著差异。连锁不平衡分析表明,g.66117C>T和g.66251A>G在草原红牛群体中处于强连锁不平衡状态。3.黄牛Pax7基因多态位点与生长性状的关联分析利用GLM模型统计分析了Pax7基因5个SNPs位点与秦川牛成年个体、郏县红牛成年个体和南阳牛不同生长时期（6月龄、12月龄、18月龄和24月龄）各项生长指标的关联性。结果显示,g.332 ins/del G位点与秦川牛体重、郏县红牛体斜长和南阳牛12月龄的日增重显著相关,且GG型均显著高于AG型（P<0.05）;g.3531G>A位点的不同基因型对秦川牛体斜长、胸宽和尻长及南阳牛6月龄、12月龄的多项指标影响显著（P<0.05或P<0.01）;g.56626G>A位点只与秦川牛胸深显著相关,与郏县红牛和南阳牛的各项指标均不相关;g.66117C>T位点的不同基因型对秦川牛体高和十字部高及南阳牛6月龄、12月龄的胸围和日增重影响显著（P<0.05）;g.66251A>G位点的不同基因型对秦川牛体重、胸深和坐骨端宽及郏县红牛胸围、腰角宽和尻长及南阳牛6月龄、12月龄的多项指标均有显著影响（P<0.05或P<0.01）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 我国畜禽遗传资源概况
• 1.2 我国肉牛资源及育种现状
• 1.3 转基因技术与家畜育种
• 1.3.1 转基因技术概况
• 1.3.2 转基因技术在动物育种中的应用
• 1.4 分子遗传标记技术与家畜育种
• 1.4.1 分子标记技术概述
• 1.4.2 分子标记的分类
• 1.4.3 标记辅助选育及其应用
• 1.5 候选基因的研究进展
• 1.5.1 肌肉卫星细胞概述
• 1.5.2 Myf5 基因研究进展
• 1.5.3 Pax7 基因研究进展
• 1.6 研究的目的及意义
• 第二章 黄牛Myf5 基因克隆与表达研究
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 基因克隆及载体构建方面
• 2.1.2 蛋白表达方面
• 2.1.3 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 Myf5 基因CDS 区扩增
• 2.2.3 原核表达载体的构建及表达
• 2.2.4 真核表达载体的构建及表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Over-lap 法扩增Myf5 基因CDS 区
• 2.3.2 载体的构建与鉴定
• 2.3.3 目的基因的原核表达
• 2.3.4 重组蛋白Western blot 检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于目的基因的获得
• 2.4.2 关于载体的选择和蛋白表达
• 2.4.3 关于脂质体转染细胞
• 2.5 小结
• 第三章 黄牛Pax7 基因多态性检测及其遗传效应研究
• 3.1 试验材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 黄牛基因组DNA 的检测
• 3.2.2 黄牛Pax7 基因片段的扩增及琼脂糖电泳检测
• 3.2.3 混合DNA 池测序检测黄牛Pax7 基因多态位点
• 3.2.4 黄牛Pax7 基因多态位点的PCR-RFLP 分析
• 3.2.5 黄牛Pax7 基因多态位点的群体遗传结构分析
• 3.2.6 黄牛Pax7 基因多态位点的单倍型分析
• 3.2.7 黄牛Pax7 基因5 个多态位点间的连锁不平衡分析
• 3.2.8 黄牛Pax7 基因多态位点与生长性状的关联分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于DNA 池测序检测SNPs
• 3.3.2 关于Pax7 基因SNP 位点的分析
• 3.3.3 关于Pax7 基因多态位点的群体遗传学分析
• 3.3.4 关于Pax7 基因多态位点间的连锁不平衡分析
• 3.3.5 关于Pax7 基因的遗传效应分析
• 3.4 小结
• 结论与创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介