论文摘要
品种的真实性和纯度是种子检测最重要的指标之一，而研究快速、准确、简便的ＤＮＡ分子标记技术鉴定甜菜种子和将来新品种授权均具有重要的意义。本研究首次利用SSR分子标记对我国生产上应用的甜菜品种进行指纹图谱的构建，同时对影响品种纯度和真实性鉴定的各种因素进行系统的分析，建立了一套快速、高效的品种纯度和真实性鉴定方法，使快速鉴定甜菜品种及不同实验室的交流成为可能。主要结果如下：1.建立了快速高效提取甜菜基因组DNA的方法。本研究使用甜菜干种子或者叶片经真空冷冻干燥机处理1-2天后的干粉为原料，使用96孔PCR板代替单个离心管，利用碱裂解法对两种样品进行DNA的提取，该方法无需使用液氮，提取上百份DNA仅需要20分钟,提取的DNA能够作为SSR-PCR的模板。2．筛选出29对可用于指纹图谱构建的SSR核心引物。利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对101对甜菜SSR扩增产物进行检测，共找到29对带型清晰、重复性好、多态性高、易于识别的引物，每对引物平均扩增出2～11个等位基因。扩增的片段大小在90～500bp之间，这29对引物可以作为甜菜品种纯度和真实性鉴定的核心引物。3．建立了甜菜多重SSR-PCR扩增体系。在单一SSR～PCR的基础上，甜菜2～3重SSR-PCR的体系为：每增加1重SSR，仅仅增加相应引物的量以及减少相应去离子水的量，其余成分不变。甜菜4～5重SSR-PCR要在单一PCR的基础上增加0.5倍的DNTPs以及相应引物的量，同时根据个别引物扩增效率的不同，相应减少个别引物的用量，此体系对大多数4重和5重PCR有效。多重PCR扩增体系的检测效率是单引物PCR的2～5倍。4.有7对引物可单独进行品种鉴定，利用其中3对引物构建了46个甜菜品种的SSR指纹图谱。聚类分析结果表明，在遗传距离0.20处，所有的品种被分为一类，在遗传距离0.16处，46个品种被分为4个类群，聚类分析结果与材料的来源有很好的一致性，基本上是同一公司或者同一国别的品种聚在了一起，从分子水平上说明了甜菜品种之间的遗传基础狭窄。另外，有7对引物SB04、S7、S6、BVV45、SB13、S13和S8单独使用时能够鉴别不同的品种，利用其中的3对引物SB04、S6和S7构建的指纹图谱就能区别所有的品种。5.建立了一套快速鉴定甜菜品种纯度和真实性的方法。该方法使用96孔PCR板，利用碱裂解法提取干粉DNA；使用GV及λ DNA检测提取样品DNA的浓度和质量； PCR反应体系为10μL；PCR反应程序将循环中的变性和退火温度均改为15s,延伸为30s，35个循环；PCR产物的分离使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后使用快速银染法对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行检测；同时我们将模板DNA、引物稀释到工作浓度后和DNTPs以及PCR Buffer一起放入到冰箱保鲜层中，使用时不需要融化，可直接吸取，3个月内均能正常使用。利用以上的方法最终确立了一套简单、快速、节约、污染小的甜菜品种真实性和纯度的鉴定体系,促进了该技术的大规模使用，利用优化后的程序，一个成熟的实验室操作人员只需一天就可以完成192份样品的检测。
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摘要Abstract第一章 综述1.1 品种纯度和真实性鉴定的意义及现状1.1.1 构建甜菜品种特征指纹图谱的意义1.1.2 种子真实性和纯度鉴定的方法1.2 应用 SSR 分子标记鉴定甜菜品种的真实性和纯度需要解决的问题1.2.1 快速提取甜菜基因组 DNA 的研究1.2.2 SSR-PCR 反应体系和程序的优化1.2.3 甜菜多重 SSR-PCR 反应体系的优化以及产物检测方法的改进1.2.4 甜菜 SSR 核心引物的筛选及指纹图谱的构建1.3 本研究的目的意义和技术路线第二章 不同方法快速提取甜菜干种子基因组 DNA 的研究摘要2.1 试验材料和方法2.1.1 试验材料2.1.2 试验试剂2.1.3 试验仪器2.1.4 试验方法2.2 结果和分析2.2.1 不同碱裂解法提取 DNA 浓度与纯度的检测2.2.2 SSR 结果分析2.2.3 不同方法提取甜菜干种子 DNA 浓度及纯度的检测2.2.4 不同方法提取甜菜干种子 DNA 的 SSR-PCR 检测结果2.3 讨论第三章 新型核酸染料在甜菜琼脂糖电泳中的应用摘要3.1 材料和试剂3.1.1 实验材料3.1.2 实验试剂3.1.3 主要仪器3.2 实验方法3.2.1 DNA 的提取3.2.2 1% 琼脂糖制备3.2.3 利用λ DNA 检测甜菜基因组 DNA 的浓度3.2.4 利用 GV 对 PCR 产物进行检测3.3 结果分析3.3.1 不同染料检测结果3.3.2 GV 对 PCR 产物检测的结果3.4 讨论第四章 甜菜 SSR 核心引物的筛选以及多重 PCR 体系的建立摘要4.1 实验材料和方法4.1.1 实验材料4.1.2 DNA 的提取4.1.3 实验中使用的 SSR 引物4.1.4 PCR 反应体系4.1.5 PCR 扩增产物的电泳及检测4.2 结果分析4.2.1 甜菜 SSR 核心引物的筛选4.2.2 能够构建多重 SSR-PCR 反应的引物4.2.3 甜菜 2-3 重 SSR-PCR 扩增体系的建立4.2.4 4 重和 5 重 SSR-PCR 反应体系4.2.5 4 重和 5 重 SSR-PCR 反应体系的优化4.3.讨论第五章 46 份甜菜品种的 SSR 指纹图谱构建及遗传关系分析摘要5.1 材料与方法5.1.1 供试材料5.1.2 方法5.2 结果与分析5.2.1 DNA 提取结果及检测5.2.2 SSR 引物的扩增5.2.3 SSR 指纹图谱的构建5.2.4 聚类分析5.3 讨论第六章 快速鉴定甜菜品种纯度和真实性的研究摘要6.1 鉴定体系的优化6.1.1 DNA 提取方法的优化6.1.2 DNA 检测方法的优化6.1.3 PCR 反应体系和程序的优化6.1.4 电泳检测方法的优化6.2 结果与分析6.2.1 两种快速提取甜菜基因组 DNA 的比对6.2.2 PCR 反应体系和反应程序的优化6.2.3 优化后的方法与原方法对比结果6.2.4 PCR 反应体系和程序优化的比较6.3 讨论第七章 全文结论和创新点7.1 全文结论7.2 创新点参考文献附录致谢作者简历在读期间发表的主要论文在读期间发表的著作
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