绿豆环氧水解酶基因克隆、表达及酶学性质表征

论文摘要

环氧水解酶（Epoxide hydrolase, EH）能催化合成光学纯环氧化合物和邻位二醇,在医药、绿色精细化工等领域具有重要应用前景。近年新发现的绿豆EH （mbEH）能对映归一性水解消旋环氧化物产生单一构型的R-邻位二醇,底物转化率与立体选择性达90%以上,是更一种实用的生物催化剂。本论文首次获得了一种mbEH的编码序列,实现了该基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达,对重组绿豆EH进行了纯化和酶学性质表征。首先,比较了UNIQ-10柱式法、Trizol法和改良Trizol法对绿豆种子、绿豆胚芽和绿豆芽总RNA抽提效果,选定改良Trizol法抽提目标RNA;RT-PCR仅从绿豆胚芽RNA中扩增到部分绿豆EH编码序列,说明该基因的表达存在时间差异性；利用cDNA末端快速扩增（RACE）法获得mbEH A全长序列,该序列含有960bp的开放阅读框、117bp和239bp的上下游非编码序列；通过三维建模方法获得衍生的mbEH A的三维模型。其次,成功构建了mbEH A的重组质粒pET-28a-mbEH A,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得重组表达菌；经IPTG诱导,重组mbEH A表达量约占菌体总蛋白的30%,分子量为41 kDa,等电点pI为6.02；金属螫合亲和层析法一步纯化了重组酶,纯度和回收率均在85%以上；以对硝基苯乙烯氧化物（pNSO）为底物,重组酶活力比天然酶提高了近500倍。酶学性质分析表明,重组mbEH A能对映归一性水解pNSO,且主要产生R-二醇；相对顺式-pNSO而言,更倾向于优先水解反式-pNSO该酶的最适反应pH和最适反应温度分别为pH7.0和25℃,米氏常数Km为2.05 mM,最大反应速率Vmax为14.8μmol·min-1·mg-1;重组mbEH A基本不耐热性,在pH6-10较稳定；有较强的有机溶剂耐受性,10%苯、甲苯或二甲基亚砜中活力残留50%左右,甲醇、异丙醇对酶活有促进作用；聚乙二醇、吐温、曲拉通等也能明显促进重组酶活力。最后,初步摸索了重组mbEH A真空冻干条件。低浓度的海藻糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸均对重组酶的冻干有良好保护性,5%海藻糖和1%蔗糖的保护效果最好,分别为92.4%和92.1%；对大规模冻干而言,1%蔗糖作为保护剂更经济实用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 手性物质的重要性及生物催化技术概述
• 1.1.1 手性环氧化物及邻位二醇简介
• 1.1.2 手性环氧化物及邻位二醇的合成
• 1.1.2.1 化学法
• 1.1.2.2 生物法
• 1.2 环氧化物水解酶
• 1.2.1 酶的结构和催化机制
• 1.2.1.1 柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶家族的结构和催化机制
• 1.2.1.2 α/β-环氧水解酶家族的结构和催化机制
• 1.2.2 底物特异性
• 1.2.2.1 大小和形状
• 1.2.2.2 催化动力学
• 1.2.2.3 区域专一性
• 1.2.3 新酶
• 1.2.3.1 探索新的环氧水解酶
• 1.2.3.2 环氧水解酶催化性能的定向进化
• 1.2.3.3 催化中心位点的突变
• 1.2.3.4 非催化残基的突变
• 1.3 本论文的目的和意义
• 第2章 绿豆总RNA的提取
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料、仪器与试剂
• 2.2.1.1 材料
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.1.3 试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 UNIQ-10柱法提取RNA
• 2.2.2.2 Trizol法提取RNA
• 2.2.2.3 改良Trizol法提取RNA
• 2.2.2.4 mRNA反转录
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA样品纯度光谱分析
• 2.3.2 RNA样品纯度电泳检测
• 2.3.3 GAPDH内参基因PCR检测
• 2.4 本章小结
• 第3章 绿豆环氧水解酶的克隆、表达优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 药品与试剂
• 3.2.1.2 菌株和质粒
• 3.2.1.3 PCR引物
• 3.2.1.4 微生物培养基
• 3.2.1.5 缓冲液
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 绿豆环氧水解酶基因ORF框扩增
• 3.2.2.2 cDNA末端快速扩增
• 3.2.2.3 绿豆环氧水解酶RNA全长序列的获取
• 3.2.2.4 菌落PCR
• 3.2.2.5 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.2.6 DNA产物纯化及DNA电泳胶回收
• 3.2.2.7 目的片断与载体连接
• 3.2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.2.9 大肠杆菌的钙转化
• 3.2.2.10 细菌培养及菌种保藏
• 3.2.2.11 质粒提取
• 3.2.2.12 目的基因的克隆及测序
• 3.2.2.13 mbEH A的序列分析
• 3.2.2.14 mbEHA的三维结构模拟和活性中心预测
• 3.2.2.15 目的蛋白的初步表达
• 3.2.2.16 诱导温度对脂肪酶表达活力的影响
• 3.2.2.17 IPTG浓度对环氧水解酶表达活力的影响
• 3.2.2.18 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 mbEH A ORF框PCR引物设计
• 3.3.2 PCR扩增获得mbEH A基因ORF
• 3.3.3 环氧水解酶片段与PMD18-T载体连接
• 3.3.4 mbEH A cDNA全长获取
• 3.3.4.1 cDNA末端快速扩增
• 3.3.4.2 mbEH A cDNA全长序列PCR
• 3.3.5 mbEH A序列分析
• 3.3.5.1 进化树和蛋白比对
• 3.3.5.2 蛋白三维结构及活性中心分析
• 3.3.6 重组表达载体pET28a的构建
• 3.3.7 绿豆环氧水解酶在大肠杆菌中的表达
• 3.3.8 不同诱导温度对环氧水解酶可溶性表达的影响
• 3.3.9 IPTG浓度对环氧水解酶表达的影响
• 3.4 本章小结
• 第4章 蛋白纯化及酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 仪器
• 4.2.1.2 试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 酶活测定方法
• 4.2.2.2 pET28a-mbEH A重组环氧水解酶的纯化
• 4.2.2.3 Bradford法定蛋白
• 4.2.2.4 Km值及Vmax值的测定
• 4.2.2.5 环氧水解酶性质的初步研究
• 4.2.2.6 HPCL检测环氧水解对映归一性水解
• 4.3 结果和分析
• 4.3.1 酶活测定方法
• 4.3.1.1 565nm吸光度测定酶活
• 4.3.1.2 570nm吸光度测定酶活
• 4.3.1.3 280nm吸光度测定酶活
• 4.3.2 pET28a-mbEH A重组环氧水解酶的纯化
• 4.3.2.1 硫酸铵沉淀粗酶
• 4.3.2.2 Ni柱亲核层析
• 4.3.3 Km值及Vmax值的测定
• 4.3.4 pET28a-mbEH A重组酶的性质研究
• 4.3.4.1 最适温度和温度稳定性
• 4.3.4.2 最适pH和pH稳定性
• 4.3.4.3 化学试剂对环氧水解酶活力的影响
• 4.3.4.4 酶对有机溶剂的耐受性
• 4.3.5 HPLC检测mbEH对pNSO的对映归一性水解
• 4.4 本章小结
• 第5章 重组环氧水解酶冻干条件摸索
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料、仪器与试剂
• 5.2.1.1 材料
• 5.2.1.2 仪器与试剂
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 重组mbEH A酶液制备
• 5.2.2.2 冻干样品制备
• 5.2.2.3 真空冷冻干燥法制备重组mbEH A粉剂
• 5.2.2.4 酶活测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 海藻糖对环氧水解酶冻干保护的影响
• 5.3.2 乳糖对环氧水解酶冻干保护的影响
• 5.3.3 山梨醇对环氧水解酶冻干保护的影响
• 5.3.4 蔗糖对环氧水解酶冻干保护的影响
• 5.3.5 甘露醇对环氧水解酶冻干保护的影响
• 5.3.6 甘氨酸对环氧水解酶冻干保护的影响
• 5.4 本章小结
• 第6章 总结与展望
• 6.1 全文总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间的研究成果