农杆菌及基因枪法介导的BAR基因在高羊茅中的遗传转化效率研究

论文摘要

高羊茅（Festuca arundinacea Shreb.）属于禾本科羊茅属植物,是一种在世界温带地区应用非常广泛的冷季型牧草和草坪草,利用基因工程技术对其进行品种改良一直备受人们的关注。农杆菌介导法和基因枪转化法是牧草和草坪草遗传转化上应用最广泛的两种方法,本实验将两种介导方法同时应用在高羊茅的遗传转化上,并对其转化效率、转基因的拷贝数以及转基因在植物中的表达情况进行了研究。主要研究结果如下:1.高羊茅离体再生体系的优化实验。本实验主要以高羊茅成熟种子的胚为外植体,研究了不同浓度6-BA对愈伤组织的诱导和再生的影响。在MS5诱导培养基中添加不同浓度的6-BA,浓度梯度分别为:0,0.2,0.5,1.0（mg/L）。结果表明,当MS5诱导培养基中添加0.2mg/L的6-BA时,可用于遗传转化的胚性愈伤组织的诱导率和再生率都是最高的。分别为3.3%和82%。2.高羊茅遗传转化体系的建立。本研究应用农杆菌介导法和基因枪转化法对4个不同克隆的愈伤组织进行遗传转化,bar基因被用作选择标记基因,在转化后的抗性愈伤筛选培养基和再生培养基中,均添加2mg/L的bialaphos作为选择剂,每2～3周继代一次。3.抗性植株的检测。实验结果表明,农杆菌法和基因枪法的平均转化效率分别为10.5%和11.5%。取转化植株的新鲜叶片进行GUS染色,我们发现农杆菌介导的植株中有53%的植株叶片呈现不同程度的蓝色。而基因枪转化的植株中只有20%观察到了不同程度的蓝色。有蓝色出现的叶片说明了uidA基因的稳定表达。对所有转化植株喷Basta,7d以后观察发现非转基因对照植物全部死亡,而转基因植株则没有受到任何伤害。提取转化植株的RNA进行RT-PCR扩增,结果显示,除了非转基因对照植物以外,所有的转基因植株均扩增出了400bp的bar基因cDNA片断。说明了bar基因得到了稳定表达并表现出对除草剂的抗性。提取抗性植株的基因组DNA进行Southern杂交分析。结果显示,两种转化方法所获得的转基因植株中,大多数都为转基因低拷贝数植物,且bar基因以及uidA基因的插入模式和片段极为相似。农杆菌转化的植株中,有63%含有选择标记bar基因完整插入,基因枪法转化的植株中有50%,其中单拷贝百分数分别为32%和20%。用uidA探针杂交后,有来自农杆菌法转化的47%的植株以及来自基因枪法转化的30%的植株含有预期的的两个以内的条带。综上所述,就转基因表达的稳定性而言,农杆菌转化法比基因枪法具有更大的优势。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 一、文献综述
• 1. 植物转基因技术的研究进展
• 1.1 遗传转化的受体系统
• 1.1.1 愈伤组织的培养
• 1.1.2 悬浮细胞的培养
• 1.1.3 原生质体培养
• 1.1.4 花药培养
• 1.1.5 茎尖培养
• 1.2 植物的遗传转化方法
• 1.2.1 原生质体直接吸入法
• 1.2.2 基因枪转化法
• 1.2.3 农杆菌转化法
• 1.2.4 硅碳纤维介导法
• 1.2.5 花粉管通道法
• 1.2.6 电激法
• 1.2.7 PEG 法
• 1.3 外源基因在转基因植株中的表达
• 1.4 转基因植物的筛选和鉴定
• 1.4.1 报告基因
• 1.4.2 选择标记基因
• 1.4.3 转基因植物的分子生物学检测
• 2. 转基因技术在牧草及草坪草育种中的应用
• 2.1 提高抗逆性
• 2.2 提高抗病虫害的能力
• 2.3 改良抗除草剂性能
• 2.4 调控花粉过敏源
• 2.5 改良品质
• 3. 草坪草及牧草遗传转化中所存在的问题及应用前景
• 4. 工作的目的和意义
• 二、材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 培养基
• 2. 实验方法
• 2.1 高羊茅成熟胚离体再生体系的建立
• 2.1.1 高羊茅种子的消毒
• 2.1.2 愈伤组织的诱导和继代
• 2.1.3 愈伤组织的再生
• 2.1.4 数据统计
• 2.2 基因枪法对高羊茅进行bar 基因遗传转化
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 质粒的构建
• 2.2.3 质粒的提取
• 2.2.4 质粒的电泳检测及浓度测定
• 2.2.5 金粉的准备
• 2.2.6 DNA 的包被
• 2.2.7 轰击受体材料的准备
• 2.2.8 轰击过程
• 2.2.9 抗性愈伤的筛选以及转化植株的再生
• 2.3 农杆菌法对高羊茅进行bar 基因的遗传转化
• 2.3.1 植物材料及菌株
• 2.3.2 质粒载体的构造
• 2.3.3 农杆菌的培养
• 2.3.4 转化受体材料的准备
• 2.3.5 农杆菌浸染过程
• 2.3.6 转化体的筛选及再生
• 2.4 β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因表达检测
• 2.4.1 β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因的瞬时表达分析
• 2.4.2 β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因的稳定表达分析
• 2.4.3 β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因在转化植株中的表达分析
• 2.5 转基因植株的RT-PCR 分析
• 2.5.1 植物RNA 的提取
• 2.5.2 反转录（Reverse transcription，RT）
• 2.5.3 PCR 扩增
• 2.6 转化植株的Southern 杂交分析
• 2.6.1 植物总DNA 的提取
• 2.6.2 Southern 杂交
• 三、结果与分析
• 1. 高羊茅离体再生体系的建立
• 2.高羊茅 bar 基因的遗传转化及转基因植株的筛选
• 2.1 GUS 基因表达情况
• 2.2 抗性愈伤及植株的筛选
• 2.3 两种转化方法的转化效率
• 2.4 抗性植株的分子生物学检测
• 四、结论
• 五、讨论
• 1. 高羊茅离体再生体系的优化
• 2.农杆菌法和基因枪法转化结果的比较分析
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介