论文摘要
肺动脉高压（pulmonary artery hypertension,PAH）是许多肺部疾病发展为慢性肺源性心脏病的重要病理生理过程。肺动脉高压的病理生理基础是肺小动脉平滑肌细胞收缩、增殖及肺小动脉重构。研究表明,肺动脉平滑肌细胞膜钾通道与肺动脉收缩及增殖密切相关。钾通道功能下降激活L-钙通道,使细胞内Ca2+([Ca2+]cyt)浓度升高,肺动脉平滑肌细胞收缩;同时增殖细胞核抗原（PCNA）、转录生长因子-β1（TGF-β1）等增殖因子增加,凋亡因子减少,促进肺动脉平滑肌细胞增殖。肺动脉平滑肌细胞膜至少存在四种钾通道:（1）电压依赖性钾（Kv）通道,（2）Ca2+激活性钾(Kca)通道,（3）ATP敏感性钾(KATP)通道,即内向整流性钾（Kir）通道,（4）二孔区钾(K2P)通道。缺氧时,KATP通道代偿性开放是机体重要的代偿机制。持续缺氧导致肺血管内皮细胞合成、分泌血管活性物质失衡,内皮素-1（ET-1）、血管紧张素Ⅱ（ANGⅡ）等缩血管物质增加,一氧化氮（NO）、前列腺素I2（PGI2）等舒血管物质减少。这些物质与肺动脉平滑肌细胞膜KATP通道正偶联或负偶联,使钾通道功能下降,细胞膜去极化,肺动脉平滑肌细胞收缩。持续肺血管收缩刺激血管增生、重构、产生肺动脉高压及右心室肥厚。因此,KATP通道在肺动脉高压形成中处于关键环节,成为研发治疗肺动脉高压新型药物的重要靶分子。新型KATP开放剂Iptakalim对SUR2B/Kir6.1靶向性更强。动物研究显示,Iptakalim可提高肺动脉平滑肌细胞外向性钾电流、抑制低氧性肺血管收缩及增殖、降低低氧大鼠肺动脉压力,还能逆转肺血管和气道重构、抑制右心室肥厚、有效预防和治疗肺动脉高压。考虑到人与动物间的物种差异,Iptakalim对人肺动脉平滑肌细胞的作用可能存在差异。目前,包括本研究在内的系列研究正在展开。本实验以ET-1及低氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞,运用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcriptive polymerase chainreaction,RQ-RT-PCR）技术,研究Iptakalim对人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响,以揭示肺动脉高压发生发展的分子生物学机制,并为Iptakalim研发成具有自主知识产权的临床治疗新药积累实验基础。第一部分Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响目的研究新型KATP开放剂Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响,以探讨Iptakalim治疗肺动脉高压的分子生物学机制。方法分离手术标本正常人肺组织3～4级肺小动脉,原代培养肺动脉平滑肌细胞。分别加入ET-1、不同浓度Iptakalim（0.1μM、1μM、10μM）及Glyburide（0.1μM、1μM、10μM）继续孵育细胞24小时。以Trizol法抽提细胞总RNA,逆转录为cDNA,以RQ-RT-PCR法检测各组细胞SUR2B/Kir6.1mRNA表达量。结果ET-1组SUR2B mRNA表达量较正常组明显减少。Iptakalim呈浓度依赖性拮抗ET-1的抑制作用,提高SUR2BmRNA表达量。Glyburide呈浓度依赖性拮抗Iptakalim的作用,减少SUR2B mRNA表达量。各组Kir6.1 mRNA表达量无统计学差异。结论新型KATP开放剂Iptakalim呈浓度依赖性拮抗ET-1的作用,增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道中SUR2B亚基mRNA表达量,提示Iptakalim通过增加人肺动脉平滑肌细胞KATP通道表达、缓解肺动脉平滑肌痉挛、增殖治疗肺动脉高压。第二部分Iptakalim对低氧诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响目的研究新型KATP开放剂Iptakalim对低氧诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响,以探讨Iptakalim治疗肺动脉高压的分子生物学机制。方法分离手术标本正常人肺组织3～4级肺小动脉,原代培养肺动脉平滑肌细胞。分别加入不同浓度Iptakalim（0.1μM、1μM、10μM）及Glyburide（0.1μM、1μM、10μM）于低氧环境下（O25%,CO25%,N2 90%）继续孵育细胞24小时。以Trizol法抽提细胞总RNA,逆转录为cDNA,以RQ-RT-PCR法检测各组细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达量。结果低氧组SUR2BmRNA表达量较正常组明显减少。Iptakalim呈浓度依赖性拮抗低氧的抑制作用,提高SUR2B mRNA表达量。Glyburide呈浓度依赖性拮抗Iptakalim作用,减少SUR2B mRNA表达量。各组细胞Kir6.1 mRNA表达量无统计学差异。结论新型KATP开放剂Iptakalim呈浓度依赖性拮抗低氧的作用,增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道中SUR2B亚基mRNA表达量,提示Iptakalim通过增加人肺动脉平滑肌细胞KATP通道表达、缓解肺动脉平滑肌痉挛、增殖治疗肺动脉高压。
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