论文摘要
研究背景和目的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤。由于早期无明显症状,患者确诊时多已是中晚期,治疗有段有限、预后很差。早期诊断和早期治疗是改善肝癌患者预后的关键,甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）是目前临床应用最为广泛的HCC诊断标志物,但有20%-30%的HCC患者血清中AFP水平并不升高,其对肝癌的早期诊断价值有限。筛选能与AFP联用的新肿瘤标志物将有助于HCC早期诊断,并加深对HCC癌变机制的理解。我们前期课题应用亚细胞组分定量蛋白质组学的方法分析了肝癌细胞与正常肝细胞之间的差异蛋白谱,其中鉴定到的annexin A2是钙离子依赖的磷脂结合蛋白,参与细胞增殖和信号转导。我们发现annexin A2在肝癌组织中表达高于正常肝组织。本课题将进一步研究肝癌患者肿瘤组织和血清中annexin A2表达水平及其临床病理学特征。食管癌在全球恶性肿瘤发病率中排第8位,在导致死亡的恶性肿瘤中排第6位。按其组织学类型的不同,可以分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EA）其中ESCC占食管肿瘤病理类型的90%以上。食管癌的发病呈明显的地区分布特征,不同国家或同一国家不同地区发病率有很大差异。世界上食管癌高发区主要集中在中国、南非、伊朗、智利和巴西等地。流行病学研究证实食管癌发病与遗传、吸烟酗酒、营养不良、口腔卫生差、热饮热食以及病毒感染有关。人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是一种球形无包膜的双链环状DNA病毒,具有种属特异性,可感染人的皮肤及黏膜上皮组织,分为100多个亚型。依据感染后诱发的宫颈良恶性病变不同可分为高危型、低危型和可能致癌型三类。近年来越来越多的研究发现,HPV感染可能是食管癌的重要病因。1982年Syrjanen首先提出HPV感染和食管癌发病可能存在关联,之后众多的研究报道结论却不一致。由于样本地区来源不同、检测方法的选择差异以及样本处理过程中的污染等原因导致HPV在食管癌样本中的检出率差异很大。目前检测食管癌中HPVDNA常用的方法有核酸杂交和PCR扩增等。与原位杂交和实时定量PCR相比,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）进行多重PCR扩增（PCR-MS）技术检测肿瘤样本中HPV具有更高的灵敏度和特异度。我们收集了来自食管癌高发区和低发区的冰冻食管癌组织和癌旁组织,以及食管癌患者和健康对照的外周血,采用PCR-MS口常规的通用引物PCR两种方法检测样本中的HPV感染情况。食管癌细胞系是研究肿瘤侵袭转移、疾病诊断和药物敏感性不可或缺的工具。文献报道部分ESCC细胞系存在HPV感染,并被应用在HPV感染致食管上皮癌变机制的研究中,但是这些细胞系真实身份有待鉴定。细胞在长期的体外培养的过程中,由于标记错误和身份识别错误会出现细胞交叉污染。使用这些身份错误的细胞进行科学研究,严重影响实验质量的可靠性和重复性,是细胞实验中应高度重视的问题。目前食管鳞癌细胞系身份鉴定的报道很少,本课题采用短串联重复序列（short tandem repeat, STR）图谱的方法鉴定了本实验室保存的9株食管鳞癌细胞系,并检测了细胞系中HPV感染情况。食管癌患者组织样本中HPV拷贝数很低,病毒感染可能存在“打了就跑”的致癌机制,而血清中HPV自身抗体的存在反映的是个体既往HPV感染情况,检测食管癌患者血清中HPV抗体为研究HPV感染与食管癌发病的关系提供新的证据。传统检测血清抗体的方法是酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosordent assay ELISA）,该方法用于检测自身抗体的抗原不易获得,检测的自身抗体有限,且不能鉴定抗体识别的抗原表位。肽扫描（peptide scanning）技术利用设计合成的多肽,模拟蛋白抗原与抗体结合,不仅能发现抗体的有无,还能用于鉴定抗体识别的抗原表位。血清中HPVL1抗体反映个体既往曾暴露HPV感染,但不适于HPV相关的肿瘤筛查。在健康人群血清中HPV L1抗体比较常见,但是高危型HPV E6/E7癌蛋白抗体却少见,故HPV的E6E7抗体与病毒DNA关联程度高于HPVL1抗体。本研究拟应用肽扫描技术研究食管癌患者血清中的HPV16E6/E7自身抗体,筛选HPV16E6/E7自身抗体识别的抗原表位。材料和方法通过免疫组化方法检测195例HCC组织芯片中的annexin A2表达水平；使用自建的酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测404例血清样本（包括早期肝癌95例,晚期肝癌80例,肝炎23例、肝炎后肝硬化51例、肝良性肿瘤19例、健康对照49例和87例其它肿瘤）中annexinA2表达水平；同时采用商品化试剂盒测定血清样本中AFP含量。通过受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC）的曲线下面积（area under curve, AUC）匕较血清中AFP与annexin A2两者诊断HCC的敏感度和特异度；采集p21-HBx转基因小鼠肝癌模型不同时间段的组织和血清,检测其中annexin A2表达水平。收集了74对手术切除的食管癌肿瘤组织和配对的癌旁正常组织,其中39例样本来自食管癌高发区安阳市,35例样本来自食管癌低发区北京市。同时收集了239例外周血,包括139例食管癌患者外周血和100例健康对照的外周血,样本均来自北京市。在样本采集、DNA提取和检测过程采取严格措施避免样本间的交叉污染和人为污染。针对15个高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82型）、12个低危型HPV（6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、CP6108型）和3个可能致癌型HPV（26、53、66型）共30种HPV型别设计多重PCR引物和单碱基延伸探针,建立了新的PCR-MS检测HPV平台。利用这一平台和常规的通用引物PCR方法检测组织和外周血DNA样本中的HPV感染情况。提取KYSE140、KYSE150、 KYSE170、KYSE180、KYSE410、KYSE510、WHCO1、EC109和EC9706等9株ESCC细胞系DNA,采用STR图谱方法测定这些细胞系的基因位点并与细胞库中STR图谱数据库进行比对；采用PCR-MS平台检测细胞系中的HPV感染情况。利用点合成（SPOT synthesis）技术在纤维素膜上叠瓦式合成覆盖HPV16E6/E7蛋白全部序列的多肽阵列,每个点对应18肽的多肽链,相邻点之间重叠2个氨基酸。然后将多肽阵列与商品化抗体、食管癌患者和健康对照者混合血清分别杂交,确定HPV16E6/E7商品化抗体和血清中自身抗体识别的抗原表位。统计分析：计量资料以中位数（范围）或均数±标准差表示,非正态分布资料分组间比较采用非参数Mann-Whitney U方法分析,多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。均数间比较用两独立样本t检验进行分析。两组间率的比较用x2检验分析。以受试者工作特征曲线下面积评价annexinA2区分肝癌的诊断效能。所有数据均使用SPSS190统计软件进行分析。所有结果均采用双侧检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。研究结果Annexin A2在59.5%（116/195）肝癌组织中阳性表达,而配对癌旁正常组织中阳性率仅12.8%（25/195）,表明其在肿瘤组织中表达水平显著升高（x2检验,P<0.0001）。在HCC患者血清中annexin A2表达水平（中位值为24.75ng/μl）明显高于健康对照（中位值为16.70ng/μl）、肝炎（中位值为6.48ng/μl）、肝炎后肝硬化（中位值为7.39ng/μl）（Mann-Whitney检验,均为P<0.0001）、肝良性肿瘤（中位值为19.92ng/μl）（Mann-Whitney检验,P=0.002）和其他恶性肿瘤（中位值为3.75ng/μl）（Mann-Whitney检验,P<0.0001）。在早期肝癌和AFP阴性的肝癌患者中,分别有83.2%（79/95）和78.4%（58/74）的个体血清annexin A2水平升高,中位值分别为24.32ng/μl和24.09ng/μl。联合检测annexingA2和AFP对肝癌诊断效果最佳（AUC=0.86,95%置信区间：0.81-0.90）。对于诊断早期肝癌而言,annexin A2的灵敏度（AUC=0.79,95%置信区间：0.73--0.85）优于AFP（AUC=0.73,95%置信区间：0.66-0.80）。而两个指标联合使用的诊断灵敏度达到87.4%,优于单一指标检测。另外,在p21-HBx转基因小鼠肝癌模型中,amnnexin A2仅在荷瘤小鼠的肿瘤组织中强阳性表达,在野生型或转基因小鼠的正常肝组织中基本不表达,并且荷瘤的转基因小鼠血清中annexin A2表达水平明显高于不荷瘤的小鼠,与人类样本中观察到的结果一致。经PCR-MS和通用引物PCR两种方法检测,74例肿瘤组织/配对的癌旁组织DNA和239例食管癌患者/健康对照的外周血DNA中均未检测到HPV。本实验室保存的9株食管癌细胞系的STR图谱结果提示没有人类细胞混合污染。KYSE140、KYSE150、KYSE170、KYSE180、KYSE510和EC109的STR图谱与细胞库中数据一致。WCHO1尚未被官方细胞库保藏。KYSE410的STR图谱与KYSE150一致,EC9706的STR图谱与HeLa一致。身份正确的7株食管癌细胞系均没有HPV感染。商品化HPV16E6多克隆抗体识别的抗原表位位于MHQKRTAMFQDPQER PRKLPQLCTELQTTI,商品化HPV16E7单克隆抗体识别的抗原表位是TTDLYCYE。健康对照混合血清中HPV16E6/E7抗体少见,识别位点少。食管癌患者血清中HPV16E6/E7自身抗体多见,可识别某些共同的抗原表位,其抗原表位与健康对照不同。研究结论AnnexinA2在HCC患者血清和肿瘤组织中的表达水平均高于非肝癌对照组,annexin A2是HCC独立的血清学标志物,尤其适用于早期和AFP阴性HCC的诊断,annexin A2AFP联合检测可以提高诊断肝癌的灵敏度和特异度。前瞻性的研究有助于进一步系统评估annexin A2在肝癌诊断中的临床价值。采取严格的预防污染措施和高灵敏度、高特异度的检测方法,未能在高发区和低发区的食管癌组织和食管癌患者外周血中检测到HPV,尚需扩大样本量才能得出可靠结论。实验室保存的EC9706和KYSE410存在身份错误,这两株细胞不宜再继续使用。文献报道的HPV阳性的EC109和EC9706细胞系可能存在细胞交叉污染。细胞交叉污染并不少见,使用来源可靠、身份正确的细胞系是进行科学研究的必要条件,细胞系在使用前需常规进行身份鉴定。食管癌患者血清中HPV16E6/E7自身抗体多见,特异性识别不同肽段的序列,其抗原表位与健康对照不同。食管癌患者血清中HPV16E6/E7自身抗体及其识别抗原表位的发现为研究HPV感染与食管癌发病提供新的研究线索。