论文摘要
纤维素是植物细胞壁的主要结构组成物,是由β-1,4糖苷键组成的地球上最丰富的葡萄糖残基同聚物。近年来,通过纤维素的生物降解和发酵生产生物燃料和其他附加价值的产品已成为一种重要的潜在能源。纤维素的生物降解包括三种纤维素酶:葡聚糖内切酶（endo-β-1,4-glucanases,EC 3.2.1.4,）,葡聚糖外切酶,又称纤维二糖水解酶（exo-β-1,D-glucanases,Cellobiohydrolases,EC3.2.1.91）和β-葡聚糖苷酶（β-glucosidases,EC 3.2.1.21）等的共同作用,首先成为葡萄糖,最后经过发酵成为乙醇。前两类酶将不溶性的纤维素水解为可溶性的低聚糖,而β-葡聚糖苷酶又将该低聚糖分解为自由葡萄糖。这些纤维素酶基本上是一种模块化的酶,包括催化模块和一个或多个辅助模块。对于后者来讲,最常见的是糖基结合模块（Carbohydrate binding modules简称CBM）。糖基结合模块是具有特征性折叠结构的邻近的氨基酸片段,能够结合糖类基质。通过一级和二级的结构相似性,糖基激活酶数据库（http://www.cazy.org）目前列出了52族CBM。基于结构和功能的关系,对于结合在纤维素上的CBM,很多属于第2族。此族中的CBM,到目前为止,在大量的微生物体内出现,包括12种细菌,两种古细菌,12中真核生物和7种病毒。按照作用底物的特异性,CBM2分为两个亚组,CBM2a结合纤维素,CBM2b结合木聚糖（xylan）。尽管这两亚族都含有约100个氨基酸并折叠成相似的β三明质（β-sandwich）结构,其主要差异是模块的结合面。在CBM2a中,纤维素结合表面由于含有三个色氨酸残基而呈疏水性,该三个色氨酸残基对于纤维素的结合是必要的。目前的研究表明,结合模块主要表现出两方面的功能:一是促使酶在不溶纤维素体上的结合,二是减弱纤维素晶体结构中氢键网络的稳定性。然而通过荧光光漂白恢复技术对结合表面扩散的测量表明,CBM对纤维素的结合是动态的,模块在晶体纤维素表面上移动,用表面分析技术测试蛋白质在不溶性物质表面上作用,对于直观和深入地了解这种移动的过程和机理是十分必要的。在本研究中,我们克隆和表达了粪碱纤维单胞菌分泌的内切纤维素酶A（CenA）的部分基因序列,该序列编码信息肽和糖基结合模块(CBMCenA)。同时为利用原子力显微镜（AFM）研究结合模块的动力学特性,通过结构预测和定点变异,将该结合模块中87位的苏氨酸替代为半胱氨酸(CBMCenAT87C)使其能共价结合到AFM的探针金片上。在突变体CBMCenAT87C的基础上,我们又重组了四个突变体(CBMCenAT87C+W81A;CBMCenAT87C+N114W;CBMCenAT87C+N114Y;CBMCenAT87C+N114F)以用来测试对纤维素的结合性质。方法1.以完整的cenA基因为模板PCR扩增基因前426个碱基对,上游引物和下游引物分别为5’-ATCCAGATCGAATTCATGTCCACCCGCAGAACC-3·和5’-AATTTACATAAGCTTTCAGCTGGTCGTCGGCACGGTGCC-3’（下划线部分分别为EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点）。2.扩增的开放阅读框由高纯PCR产物纯化试剂盒提纯,以EcoRⅠ和HindⅢ酶切,然后与同样酶切的pET30a（+）质粒连接。3.将融合质粒转化进E.coli DH5α感受态细胞中。从转化株中分离构建体,通过凝胶电泳筛选大小正确的插入子,然后进行序列测定以确定目的核酸的插入。将获得的构建体命名为pACHJ-1。4.通过定点突变,将完整CenA的结合模块中87位的苏氨酸替代为半胱氨酸。以pACHJ-1为模板,使用Pfu Turbo DNA聚合酶,按照QuikChange定点突变的方法,正向引物为5’-GCGTCGTGCAACGGCGGCCAGGTC-3’,反向引物为5’-GCCGTTGCACGACGCGGTGCCGTTCC-3’（改变的核酸分别用黑体字标示）。PCR扩增后,在50μLPCR反应混合物中加入DpnⅠ酶,在37℃下反应至少1小时以去除原始甲基化的模板。所得质粒（pACHJ-2）转化进E.coliDH5α细胞中。通过DNA测序筛选正确的突变体。5.将pACHJ-1或pACHJ-2转化进E.coli BL21（DE3）细胞中,然后在含50μg/mL卡那霉素的LB肉汤37℃孵育。当培养液的吸光度达到0.6时,加入IPTG,使最终浓度为0.1到1mM以利于基因表达。分别在15℃,30℃,和37℃下孵育细胞并以吸光度监测细胞的生长。6.目的蛋白用Ni2+NTA琼脂胶亲和柱和阴离子交换色谱（Source Q）进行纯化。用凝胶电泳检测纯化程度,以蛋白印迹确定目的蛋白。7.以微晶纤维素为对象,用纤维素结合测试法进行不溶性纤维素的结合检测。在pH为7.0的50mM磷酸钠缓冲液中,利用纯化的CBM2a与微晶纤维素Avicel在4℃和30℃下进行结合实验。结合8小时后,离心除去不溶的纤维素和已经结合的蛋白质,利用紫外分光光度计测量CBM2a开始的浓度和结合后上清液的浓度,CBM2a的结合量由此两浓度之差计算。8.在突变体CBMCenAT87C的基础上,利用不同的引物,重组另外四个突变体CBMCenAT87C+W81A;CBMCenAT87C+N114W;CBMCenAT87C+N114Y;CBMCenAT87C+N114F用以结合与原子力显微镜探针上以检测对纤维素的结合动力学。结果1.编码CenA的CBM2a基因序列的克隆在cenA核酸序列的基础上,合成了合适的寡核苷酸引物用于PCR扩增。扩增产物包括编码信息肽和整个核糖结合模块的N端142个氨基酸。扩增产物被克隆进含编码His6标签的pET30a（+）载体中,然后此构建体pACHJ-1被转化进E.coli DH5α细胞中。核酸序列经测序得到确认,可以用于后续实验。2.CBM2a的产生首先CBM2a构建体pACHJ-1被转化进E.coli BL21（DE3）细胞中进行诱导表达实验。当细胞生长至对数生长期时,用不同浓度的IPTG（0.1 mM到1mM）分别在15℃,30℃,和37℃下诱导CBM2a的表达。在12小时内的表达期间内,以SDS-PAGE和蛋白印迹法分析目的蛋白表达情况。实验表明,即使在不同浓度的IPTG下延长表达时间,pACHJ-1编码的CBM2a在15℃或37℃下的表达量也相对较少。所确定的优化诱导条件是:0.5mM IPTG在30℃下诱导2.5小时。3.CBM2a的纯化利用金属离子鏊合亲和层析法(Ni2+-NTA琼脂胶)分离和纯化带His6标签的CBM2a。在pH8的缓冲溶液中将粗蛋白在树脂中上样,然后增大咪唑浓度洗脱CBM,用SDS PAGE胶确定纯度。如果细胞没有进行及时处理提取蛋白,当储存时间超过3天时,与CBM2a共同洗脱的杂蛋白会增多。通过渗析将咪唑和缓冲液中其他成分去除后,样品进一步用阴离子交换色谱（Source Q）纯化。在pH为8.5时,CBM2a保留在树脂上,将NaCl用线性梯度增加到1M,发现CBM2a在约50 mM NaCl时CBM2a被洗脱。通过渗析去除NaCl,用SDS-PAGE检测CBM2a的纯度达到98%以上。利用这种制备和纯化条件,在1升培养液中通常可以得到0.9毫克的纯CBM2a。用抗-His标签的单克隆抗体通过蛋白印迹法确认了CBM2a蛋白。4.CBM2a的纤维素结合性质在本实验条件下,CBM2a开始的浓度与结合量直接相关。对于不同的起始浓度,结合系数在78%到88%之间。令人感兴趣的是,这种结合没有随温度而有变化,因为在30℃下的有相似的结合结果。CBM2a的结合在实质上是不可逆的。在4℃或30℃下,独立的CBM2a并没有随水从不溶性的纤维素上面洗脱下来,即使用5%的SDS,回收的CBM2a也不超过25%。这种情况与缺少连接桥（Pro-Thr盒）的CenA的情况相似:此蛋白的结合被认为在实际上是不可逆的。5.定点突变在对CBM2a进行三维结构预测的基础上,半胱氨酸替代87位的苏氨酸以利于该模块结合到AFM的探针上。与推测的一致,与野生型的CBM2a相比较,该突变体保留了相同的结合特性。约74%的突变体与Avicel相结合。其他四种突变体(CBMCenAT87C+W81A;CBMCenAT87C+N114W;CBMCenAT87C+N114Y;CBMCenAT87C+N114F)也成功地得到构建,表达和纯化。用本实验方法得到的纯的突变体的浓度可以满足用AFM或其他敏感分析技术测试结合特性和机理的要求。结论1.精确地克隆并表达了由粪碱纤维单胞菌分泌的纤维素内切酶A基因（cenA）的仅编码N端前导肽和糖基结合模块（CBM）的片段,并纯化了目的蛋白,建立了诱导和表达的优化条件。2.测试了CBMCena在不溶性纤维素上的结合性质,明确了其结合的不可逆性,随起始浓度的不同,结合率在78%和88%之间。3.通过结构预测,构建了突变体CBMCenAT87C,该突变体与野生型的CBM2a相比较,保留了原有结合特性。4.在突变体CBMCenAT87C的基础上,构建,表达并纯化了四个CBMCenA突变体(CBMCenAAT87C+W81A;CBMCenAT87C+N114W;CBMCenAT87C+N114Y;CBMCenAT87C+N114F),用于原子显微镜的结合以研究其与纤维素结合的动力学性质。