论文题目: 人血小板源性生长因子基因B转染体外培养猫角膜内皮细胞的生物学效应
论文类型: 博士论文
论文专业: 眼科学
作者: 罗文娟
导师: 王传富
关键词: 角膜内皮细胞,转染,血小板源性生长因子,增殖
文献来源: 青岛大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的:通过EffecteneTM脂质体介导将自行构建的人血小板源性生长因子基因B真核表达载体（pcDNA4-PDGF-B）转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中,证明人PDGF-B基因不仅能在体外培养的猫角膜内皮细胞中得以表达并具有促进该细胞分裂再生的作用,为人角膜内皮病的基因治疗提供依据。方法:一、采用逆转录聚合酶链反应从健康产妇胎盘mRNA中扩增出PDGF-B基因片段,并连接于pcDNA4B真核表达载体上,构建重组真核表达载体pcDNA4-PDGF-B, 转入JM109大肠杆菌感受态细胞,筛选、酶切鉴定及计算机自动序列分析证明该基因为目的基因。二、组织块培养法简捷、快速体外培养出纯净的猫角膜内皮细胞单层,通过细胞形态学观察、神经特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体免疫组织化学染色及扫描和透射电镜观察鉴定细胞的种类及纯度。三、通过EffecteneTM脂质体介导将自行构建的人血小板源性生长因子基因B真核表达载体（pcDNA4-PDGF-B）转染到体外培养的猫角膜内皮细胞中,转基因后48小时通过报道基因pcDNA4-β-lacZ的表达来确定转染效率,通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及人PDGF-B单克隆抗体的免疫组织化学染色方法分别在基因水平和蛋白水平检测目的基因在该细胞中的瞬时表达情况。四、转基因后48-96小时间测猫角膜内皮细胞的MTT值,流式细胞仪测定处于G1期的细胞比例,制作体外培养猫角膜内皮细胞的定量损伤模型,统计学分析转染人PDGF-B基因对猫角膜内皮细胞DNA合成的影响和对猫角膜内皮细胞定量损伤后愈合的影响。五、利用重组质粒转染细胞的抗新霉素特性,经G418最小致死量筛选出抗性细胞克隆,免疫组织化学染色观察该细胞表达人PDGF-B基因情况。结果:一、从健康产妇胎盘组织中能克隆出人PDGF-B基因,经计算机自动测序证明所克隆基因与基因文库中报道的人PDGF-B基因序列一致。二、组织块法行猫角膜内皮细胞的体外培养简单、方便,可形成完整纯净的细胞单层,经形态学观察、NSE的免疫组织化学染色及透射和扫描电镜观察证明为纯净的猫角膜内皮细胞单层。三、EffecteneTM脂质体可介导重组真核表达载体pcDNA4-PDGF-B转染体外培养的猫角膜内皮细胞,转染效率为11.3%,RT-PCR表明人PDGF-B基因在猫角膜内皮细胞中能够得以表达,统计学分析证明转染人PDGF-B基因后的猫角膜内皮细胞中PDGF-B基因的DNA表达量明显提高,而单纯脂质体转染组人PDGF-B基因的瞬时表达无提高,人PDGF-B单克隆抗体免疫组织化学染色在人PDGF-B基因转染组见深染细胞,其余各组细胞人PDGF-B单克隆抗体免疫组织化学染色为均匀淡染。四、转染PDGF-B基因后48-96小时,猫角膜内皮细胞的MTT值,流式细胞仪测定的G1期细胞比例及猫角膜内皮细胞定量损伤后的愈
论文目录:
前言
正文
第一部分、人血小板源性生长因子B重组真核表达载体(pcDNA4-PDGF-B)的构建
目的：
pcDNA4-PDGF-B重组质粒构建图
pcDNA4B质粒图谱
pcDNA4B质粒阅读框
材料和方法：
实验材料
实验方法
一、人胎盘组织总RNA的提取
二、以人胎盘组织总RNA为模板，特异性扩增人PDGF-B cDNA基因
三、PCR产物的提纯
四、双酶切目的基因与pcDNA4B质粒DNA
五、酶切产物的纯化(同PCR产物的提纯)
六、酶切后目的基因与载体DNA的体外连接
七、感受态细胞的制备及质粒的转染(氯化钙法)
八、阳性菌DNA的粗提取
九、酶切鉴定重组质粒
十、计算机自动化基因测序
十一、pcDNA4- PDGF-B重组质粒的扩增及纯化
结果
第二部分、猫角膜内皮细胞的体外培养及鉴定
目的：
材料和方法：
实验材料
实验方法
一、有关试剂的配制
二、猫角膜内皮细胞的体外培养
三、体外培养猫角膜内皮细胞的鉴定
结果：
1、形态学观察结果
2、NSE的免疫组织化学染色鉴定结果
3、透射电镜观察结果
4、扫描电镜观察结果
第三部分、脂质体介导重组真核表达载体pcDNA4- PDGF-B转染体外培养的猫角膜内皮细胞的研究
目的
材料与方法：
实验材料
实验方法
转染原理
一、紫外分光光度仪检测质粒的纯度并调节其浓度
二、脂质体介导外源基因转染培养的猫角膜内皮细胞
三、报道基因的检测
四、RT-PCR法基因水平检测外源基因的表达
五、免疫组织化学方法蛋白水平检测外源基因的表达
结果：
一、转染效率的检测
二、细胞总RNA的提取结果
三、RT-PCR结果
四、免疫组织化学结果
第四部分、人β-NGF基因转染对体外培养的猫角膜内皮细胞分裂再生的影响
目的：
材料与方法：
实验材料
实验方法
一、MTT法检测猫角膜内皮细胞增殖活性的原理及方法
二、流式细胞仪检测转基因前后猫角膜内皮细胞中G1期细胞比例
三、人PDGF-B基因促进猫角膜内皮细胞定量损伤的制作及测量方法
结果：
一、MTT法检测猫角膜内皮细胞增殖活性结果
二、流式细胞仪检测转基因前后猫角膜内皮细胞的细胞周期结果
三、人PDGF-B基因促进猫角膜内皮细胞定量损伤的愈合结果
第五部分、稳定表达人PDGF-B基因的猫角膜内皮细胞的筛选
目的：
材料与方法：
实验材料
实验方法
一、角膜内皮细胞的G418最小致死剂量测定
二、抗性细胞克隆的筛选
三、人PDGF-B单克隆抗体的免疫组织化学染
结果：
一、猫角膜内皮细胞G418最小致死剂量测定结果
二、抗性细胞克隆的筛选结果
三、人PDGF-B单克隆抗体的免疫组织化学染色结果
讨论：
总结
结论：
参考文献：
综述
参考文献
在学期间的研究成果及发表的学术论文
致谢
发布时间: 2005-07-27
参考文献
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