论文摘要
心血管病是危害人类健康的“第一杀手”,导致全球性的经济负担。世界卫生组织（WHO）最近的报告中指出,2000-2020年心肌梗死的死亡率将由第5位上升到第1位,因心血管病引发的死亡占全球死亡人数的30%,该病严重影响着广大患者的健康。因此对心血管病发病机制和药物治疗进行研究具有重要意义。本文在前期疾病模型研究和临床研究的基础上,首次利用复合方法在小型猪体内建立病证结合的痰瘀互结证冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病,下同）模型;运用冠状动脉造影结合血管内超声以及虚拟组织成像等技术,观察冠状动脉粥样硬化的演变过程;从内皮组织损伤、冠脉血管斑块稳定性到差异蛋白质表达、细胞死亡模式等多层面、多指标研究冠心病疾病模型的病理机制,揭示痰瘀互结证候的演化过程。同时选用经典方药对病证结合模型进行治疗,初步探讨方证相应理论的规律与本质,并对模型的可靠性及病理演化过程进行反证。1痰瘀互结证冠心病小型猪模型的建立1.1材料与方法选用中国实验小型猪（Chinese experimental miniature swine,CEMS）随机分为4组:（1）正常对照组（Con）:普通饲料,不拉伤冠脉血管,n=8;（2）血瘀阻脉证候模型组（YY）:单纯冠脉拉伤,n=6;（3）痰浊壅盛证候模型组（TT）:单纯高脂饲料,n=6;（4）痰瘀互结证候模型组（TY）:冠脉拉伤+高脂饲料,n=6。对于TY模型而言,高脂饲料喂养2周后,小型猪冠脉行球囊过扩张3次,每次30s,并轻微拉动球囊2次。手术结束后,连续高脂饲料喂养8周（week,w）。其他实验方法见附表（第14页,supplementarytable）。1.2结果1.2.1一般情况冠脉损伤后4-8周,高脂饲料喂养的两种方法（TT和TY）均可以引起体重指数（BMI）明显升高,而单纯冠脉损伤（YY）对动物的BMI无明显影响。高脂饲料喂养2周后（2w-10w）TT和TY组总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）开始明显升高,与Con比较差异均有显著性意义（P＜0.01）;而冠脉损伤组（YY）与Con动物比较无明显的统计学差异。10w时,YY、TT和TY三种模型均出现血液粘度的明显升高,三者之间统计学差异。1.2.2血管活性因子和炎性因子不同类型饲料喂养2周后（2w）,两种模型动物（YY和TY）6-Keto-PGF1α/TXB2的比值与Con比较无统计学差异。而冠脉损伤后1h（2w+1h）YY和TY组比值均明显低于Con（P＜0.01）。随着造模时间延长,两个模型组6-Keto-PGF1α/TXB2比值均明显下降,造模10w YY、TY与Con比较有显著的统计学差异（P＜0.01）。YY和TY模型动物冠脉损伤后8周,hsCRP与Con之间差异有显著性意义（P＜0.01）。1.2.3缺血反应和血流动力学YY、TY模型组冠脉损伤后6-10w时缺血范围（N-ST）和缺血程度（∑-ST）均明显增加。单纯高脂饲料喂养（TT）对∑-ST、N-ST均无明显影响。冠脉损伤早期,小型猪心脏功能无明显改变,随着造模时间延长,冠脉逐渐狭窄,进行性心肌缺血造成心肌细胞丧失,逐渐导致心功能下降,YY和TY造模后6-10w时CO、LCW均明显降低,而SVR则明显增加。单纯的高脂饲料喂养（TT）对心脏的功能无明显影响。1.2.4冠脉改变2w时各组动物的冠脉管腔直径无明显差异。10w时YY和TY组冠脉管腔均明显减小,与Con相比具有显著的统计学差异（P＜0.01）;而TT组管腔与Con组相比无统计学差异。YY和TY组冠脉管腔丧失分别为（1.45±0.42）和（1.82±0.30）mm。在EVG染色中,Con组内膜（intima）、中膜（media）、外膜（adventitia）三层结构分界清楚。YY组内膜增生;TT组内膜轻微增厚,三层结构清晰;TY管腔（lumen,L）狭窄更加明显,残留管腔明显缩小,可见明显的新生内膜（neointima,NI）。YY和TY组的狭窄率、内膜厚度和中膜厚度比值（IT/MT）与Con相比均具有显著的统计学差异（P＜0.01）。1.2.5证候研究评分6w时TY组主症综合评分（BS-ECG Score）明显升高,10w时YY和TY组评分也明显升高,与Con相比具有显著的统计学差异（P＜0.01）,而单纯高脂饲料喂养（TT）对主症评分无明显影响。兼症综合评分（BMI Score）TT组自2w起明显升高,而且随着造模时间延长逐渐增加;TY组评分6w-10w时明显升高,与Con相比具有显著的统计学差异（P＜0.01）,而单纯冠脉损伤组（YY）对此评分无明显影响。舌象评分结果显示,6w时TT和TY组明显升高,10w时YY和TY组评分明显升高,与Con相比均具有显著的统计学差异（P＜0.01）。脉象评分结果显示,6w-10w时YY和TY组评分明显升高,与Con相比均具有显著的统计学差异（P＜0.01）;而单纯高脂饲料喂养（TT）对脉象评分无明显影响。1.3结论三种不同的造模方法（YY,TT,TY）对小型猪心肌缺血过程中一般情况、血管活性物质释放、缺血反应以及冠脉的改变均有不同程度的影响,但仅复合方法（TY）对上述主要指标均有明显的作用,说明复合因素模型综合单纯冠脉损伤（YY）和单纯高脂饲料喂养（TT）两种技术优势,符合痰瘀互结的病证结合理论,也有助于解释中医证候学说的科学内涵。本研究分别对胸痹心痛的主症、兼症、舌象及舌下脉络和脉象进行标准化评分和统计学处理。这种在动物体内模拟中医临床过程的研究方法,通过对动物自身信息特征的挖掘,将有利于推动病证结合模型研究的发展。2痰瘀互结证冠心病病理演化过程研究2.1材料与方法36只中国实验小型猪,随机分为6组,每组6只:（1）正常对照组（Con）:普通饲料,不拉伤冠脉血管;（2）2w+6h模型组（Model-2w+6h）:高脂饲料喂养2w+冠脉拉伤后6h;（3）3w模型组（Model-3w）:高脂饲料喂养2w+冠脉拉伤后1w;（4）4w模型组（Model-4w）:高脂饲料喂养2w+冠脉拉伤后2w;（5）6w模型组（Model-6w）:高脂饲料喂养2w+冠脉拉伤后4w;（6）10w模型组（Model-10w）:高脂饲料喂养2w+冠脉拉伤后8w。其余实验方法同前。2.2结果2.2.1一般情况从第3w起,模型组BMI逐渐升高,6w及10w模型组BMI与Con组比较有显著的统计学差异（P＜0.01）。高脂饲料喂养2周后（2w-10w）模型组总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）明显升高,甘油三酯（TG）在10w明显升高,与Con组比较均有显著的统计学差异（P＜0.01）;造模10w时全血粘度(5s-1)明显升高。2.2.2血管活性因子和炎性因子随着造模时间延长,模型组TXB2、高敏C-反应蛋白（hsCRP）、白介素-1、白介素-6及肿瘤坏死因子-α水平逐渐升高,而舒血管物质NO含量明显下降。2.2.3缺血反应和血流动力学冠脉损伤1h后模型组肌酸磷酸激酶-MB（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）开始升高,缺血范围（N-ST）和缺血程度（∑-ST）均明显增加。冠脉损伤早期（0-6h）小型猪心脏功能无明显的改变,随着造模时间延长,冠脉损伤后4-8w时CO、SV、LCW均明显降低,而SVR明显增加。2.2.4冠脉改变冠脉造影和管腔直径测量显示冠脉损伤急性期（0-6h）管腔无明显狭窄,造影剂充盈良好,管壁光滑;但损伤后随着高脂饲料喂养时间的延长,管腔逐渐狭窄,管壁不光滑。HE染色显示冠脉损伤的急性期（6h）可见管腔增粗,冠脉内皮部分脱落,3-6w组管腔狭窄处IEL断裂,内膜增生,结构紊乱,可见明显的新生内膜;10w管腔狭窄更加明显,残留管腔明显缩小,内膜增厚。管腔狭窄率（Narrow%）统计结果显示,冠脉损伤急性期（2w+6h）管腔狭窄率为5%-6%,3-10w狭窄率分别为39%、52%、60%和72%,与Con组相比均具有显著的统计学差异（P＜0.01）。2.2.5证候研究评分主症综合评分（BS-ECG Score）结果显示,随着造模时间延长,评分逐渐升高,6w-10w时评分明显升高,与Con相比具有显著的统计学差异（P＜0.01和P＜0.05）。兼症综合评分（BMI Score）、舌象和脉象评分结果也显示,随着造模时间延长,评分逐渐升高。2.3结论本文从血液流变学、内皮组织损伤和冠脉血管病理生理指标入手,结合传统中医证候研究方法,通过连续、综合因素、多指标观察证候模型的研究,揭示痰瘀互结证候的演化过程。在此过程中,血脂异常为始动因素,进而导致血液流变学异常;内皮细胞破坏,导致血管舒缩功能下降,在炎性介质的参与下血管受损处逐渐出现脂质沉积,引发心肌缺血表现,最终可影响心脏的收缩功能。3小型猪冠状动脉粥样硬化的IVUS-VH研究3.1方法行冠脉造影后,将超声导丝置入冠状动脉LAD中下部,手动回撤IVUS导管,观察受损血管的程度和受累血管的长度。再次进入IVUS导管,进行图像采集和记录。IVUS-VH数据存储于硬盘,实验完成后进行分析。斑块的边界利用灰阶（Grey scale）图像获得。VH软件自动分析斑块的构成和对应的比例。3.2结果冠脉损伤急性期（3h）,LAD管腔增大,但管壁平滑,无任何成分的斑块存在。球囊扩张后结合高脂饲料喂养1w,IVUS可见轻度的管腔狭窄,VH显示纤维斑块81.1%;冠脉损伤2w后可见较明显的管腔狭窄,VH显示内膜增厚区域72.7%由纤维斑块构成;损伤后8w可见较明显的向心性斑块,62.8%由纤维斑块构成,纤维-脂质斑块12.7%,坏死部分15.5%,钙化斑块8.9%。此时管腔面积2.7mm2,血管面积8.9mm2,狭窄率为70%。体外组织学可见1-8w有不同程度的纤维斑块增生,管腔狭窄程度逐渐加重,与IVUS-VH分析结果基本一致。3.3结论冠脉损伤后随着高脂饮食时间的延长,动脉粥样硬化斑块逐渐发展,坏死和钙化斑块的比例升高提示斑块的稳定性降低;IVUS-VH对于小型猪冠脉特点的分析与血管组织学的吻合度较好。4痰瘀互结证冠心病模型小型猪血清蛋白组学研究4.1方法应用双向凝胶电泳（2-DE）、基质辅助激光解析-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等先进的蛋白质组学技术方法,对正常和痰瘀互结证冠心病模型动物的血清进行蛋白提取、分离及鉴定。正常对照组（Con,n=30）和模型组（Model,n=30）血清样品经处理备用,WCX磁珠经预处理,制备蛋白芯片,用SELDI-TOF-MS进行检测芯片,BiomarkerWizard version 3.1软件处理蛋白峰并进行数据统计。4.2结果模型组和正常组分别平均检测出394±23、440±25个蛋白点;与参照胶平均匹配上的蛋白点数为363±25,平均匹配率为82.8%;痰瘀互结证冠心病小型猪血清与正常组相比共有17个差异蛋白点,6个上调点,1个下调点,7个缺失点,3个特异表达的点。MALDI-TOF-MS分析鉴定出complement component 4 bindingprotein、apolipoprotein E precursor等2个蛋白。SELDI-TOF-MS分析发现模型组和正常对照组相有18个蛋白峰强度具有统计学差异（P＜0.05）。其中15个峰模型组蛋白表达均明显高于正常对照组（P＜0.05）,部分蛋白表达强度的比值均高于1.5。蛋白质指纹图谱决策树模型分析研究发现,通过一个蛋白质峰（M/Z 8634）可将模型组和正常对照组血清基本分离,模型组（model）的敏感性为83.3%,特异性为100%。4.3结论小型猪动脉粥样硬化模型与正常动物的血清蛋白质组差异明显;鉴定出的C4BP、apoE等差异蛋白功能特性与痰瘀互结证冠心病免疫调控、脂质代谢、急慢性炎症反应等过程密切相关;筛选到的M/Z 8634可以作为血清生物学标志物,用以区分模型组和正常对照组动物血清。5小型猪心肌缺血后细胞死亡模式研究5.1方法心肌病理组织学观察细胞坏死,纤维增生;利用电镜技术观察心肌细胞、毛细血管形态及双层膜包绕的白噬小体的形成;Western Blotting检测Beclin 1（哺乳动物自噬的标记蛋白,参与自噬体膜的形成）、LC3（微管相关蛋白1轻链3,MAP1LC3）蛋白表达;免疫组化法检测Cathepsin B、D和Caspase-3、9的表达;通过Caspase-3活力检测及Tunel染色（FITC）观察细胞凋亡的情况。5.2结果模型组动物的心肌细胞存在明显的水肿、坏死,部分心肌存在较明显的炎性细胞浸润,这可以作为心肌细胞坏死的证据;模型组心肌细胞胞浆中Caspase-3和9表达明显高于正常对照组,Tunel染色（FITC荧光）可见阳性细胞数和Caspase-3活力均明显升高,证实了心肌细胞的凋亡现象;同时,TEM结果可见心肌细胞中双层膜的包绕自噬小体,模型组Cathepsin-B/D、Beclin-1表达同时升高,而且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,从不同角度证明了自噬的发生。5.3结论冠脉损伤最终可导致心肌血流供应障碍,坏死、凋亡及自噬均可发生,而且共同作用引起心肌细胞的缺失。掌握自噬作用与细胞凋亡、坏死的相互关系,有助于发现新的治疗靶点和策略。6痰瘀互结证冠心病方证相应的探索性研究6.1材料与方法36只中国实验小型猪,随机分为6组,每组6只:（1）正常对照组（Con）:普通饲料,不拉伤冠脉血管;（2）模型组（Model）:冠脉拉伤+高脂饲料;（3）西药对照组（XY）:辛伐他汀0.5mg/kg;（4）化痰组（HT）:瓜蒌薤白半夏汤6g生药/kg;（5）祛瘀组（QY）:血府逐瘀汤8g生药/kg;（6）痰瘀同治组（TY）:瓜蒌薤白半夏汤3g生药/kg合血府逐瘀汤4g生药/kg。冠脉拉伤后第2天开始给药,同时继续喂养高脂饲料,持续8周。6.2结果6.2.1一般情况给药8周（10w）HT组BMI明显低于模型组（P＜0.01）,其它药物治疗组对BMI无明显影响;6w时各给药组对血脂参数均无明显影响,10w时辛伐他汀（XY）和HT方药可以明显降低动物的TC和LDL-C（P＜0.05或P＜0.01）;QY和TY治疗组血液粘度(5s-1)下降,明显低于模型组（P＜0.05）。6.2.2血管活性因子和炎性因子各药物治疗均可以不同程度升高6-Keto-PGF1α/TXB2比值,组间比较无明显差异。QY和TY可以明显降低ET水平,XY和TY组可以提高NO含量。各药物治疗均可明显降低hsCRP水平。TY组在6-10w IL-6浓度降低,10w TNF-α浓度明显降低,其它药物组IL-6和TNF-α浓度无明显变化。6.2.3缺血反应和血流动力学10w时各给药组的CK-MB均下降,与模型组相比有明显的统计学差异（P＜0.05）,而XY组和QY组可以明显降低LDH的释放。三个给药组均可以明显降低∑-ST、N-ST。三种药物治疗对心脏血流动力学均有不同程度的改善,作用强度基本相当。6.2.4冠脉改变三种方药对损伤后冠脉管腔狭窄均有较好的抑制作用,并可明显增加10w时管腔直径,降低管腔丧失。其中QY和TY治疗对冠脉管腔直径的作用优于HT组。三种方药均可明显降低狭窄率,其中TY组作用最为明显。同时药物治疗可以明显减小内膜厚度与中膜厚度比值（P＜0.01 vs Model）。6.2.5证候研究评分药物治疗可以明显降低主症综合评分,而且10w时HT、TY组作用明显,与模型组相比有明显的统计学差异（P＜0.05）,而QY组作用不明显。三种治疗方法均可降低10w时脉象评分,与模型组相比具有显著的统计学差异（P＜0.01）。三种药物对兼症（BMI Score）和舌象评分无明显的降低作用。6.3结论在改善BMI和血脂增加方面,化痰法具有较好的治疗作用,而单独祛瘀法和痰瘀同治法作用较差;痰瘀互结证病理过程中的血管活性因子和炎性因子释放、血流动力学改变和冠脉狭窄等是痰瘀同治方的作用靶点,因此痰瘀同治可以更好地体现方证相应的治疗原则,取得最佳疗效。综上所述,本文在建立痰瘀互结冠心病病证结合的小型猪动物模型基础上,探索其病理机制。利用传统方药进行干预,探讨方证相应理论的规律与本质,并对模型建立的可靠性及病理演化过程进行验证。特异的蛋白质表达模式和心肌细胞死亡模式的研究则有助于寻找基本的生物学标志物及药物干预的新靶点。本文的创新性主要有如下几点:1.采用高脂饲料喂养结合冠脉内皮损伤复合方式,在实验小型猪体内建立了新的痰瘀互结证冠心病病证结合的动物模型;2.引入并初步建立病证结合动物模型的拟临床评价方法,从血液流变学、血管活性物质释放、炎性因子激活、冠脉内皮异常等方面,结合传统中医证候研究方法,基本揭示了痰瘀互结证候规律及其内在演化本质;3.在IVUS-VH和蛋白质组学等技术的辅助下,揭示了痰瘀互结所致小型猪冠脉粥样硬化发生过程中冠脉结构变化和特有蛋白质的表达,为病证结合痰瘀互结证候病理演变提供了直接证据;4.在痰瘀互结证冠心病小型猪心肌细胞中,坏死、凋亡及自噬三种主要死亡方式均可发生,而且共同作用引起心肌细胞的缺失。
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