论文摘要
研究背景糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最常见并发症,也是引起糖尿病病人死亡的最主要原因。近年来,糖尿病肾病（Diabetic nephropathy, DN）发病率呈逐年上升的趋势,从而致使慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease, CKD）的发病率和患病率不断攀升,已成为糖尿病患者的主要死亡原因之一。大量临床研究表明,未控制的高血糖是糖尿病肾病发生发展的关键因素,但其作用机制仍不清楚。因此,明确糖尿病肾病的发病机制,预防或延缓其发生及发展有着重要的科学和社会意义,符合我国国情,并有一定的迫切性。大量研究证实肾小管损伤在糖尿病肾损伤中具有重要的意义,在糖尿病肾病的早期即可观察到肾小管细胞的氧化损伤和凋亡。肾小管上皮细胞的凋亡可导致肾小管再吸收和分泌功能异常,促进肾小管上皮细胞的萎缩和间质纤维化,是糖尿病肾病进展为肾衰竭的主要因素。因此,人们开始重视肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡在糖尿病肾病发病机制中的作用。有研究表明,活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）在高血糖诱导的小管细胞损伤中起重要作用。高血糖造成肾脏小管上皮细胞ROS生成增加,ROS可活化信号转导级联效应（如PKC、MAPK、JAK/STAT等）,又可作为胞内信号激活某些转录因子（如NFκB、内皮素-1等）,导致TGF-β1等表达增加。上述信号分子进一步诱导ROS产生,不断放大高糖造成的细胞损伤,导致细胞外基质（extracellularmatrix, ECM）合成增加、基底膜增厚、系膜扩张,最终导致进行性的肾小球硬化和肾小管萎缩,引起肾功能下降和衰竭。糖尿病过度产生ROS是糖尿病合并症时细胞损伤的首要和原始启动因子。因此,研究高葡萄糖诱导ROS产生的调控机制是国际肾脏研究领域的热点。Rap1 （Ras相关蛋白1）是原癌基因Ras超家族成员之一。Rap1具有广泛的细胞生物学功能,包括细胞生长、分化、肥大、增殖,参与EMT的形成,介导肾小管离子的转运和吸收。已知Ras GTP酶与细胞内ROS产生有关；Ha-Ras-Val12突变可诱导细胞内ROS的产生；C-Raf,一个Rap1b下游蛋白,通过控制线粒体ROS的产生和Ca2+平衡,调节细胞的凋亡[54]；Ras/cAMP信号通路调节线粒体膜电位和线粒体ROS的产生,而ROS对Ras/cAMP信号又有反馈调节作用；特别是发现Epac1,一个Rap1的激活蛋白可转移至线粒体并表达在线粒体基质,而Rap1及其下游蛋白Raf也被发现在细胞线粒体,说明Rap1在线粒体ROS产生过程中可能起重要的调节作用。本实验室既往研究显示,原癌基因Ras超家族成员之一的Rap1b,可以通过逆转肾小管上皮细胞中高糖引起的线粒体ROS的生成增加以及细胞色素C的释放,抑制细胞凋亡。在之前的动物模型研究中我们发现大鼠肾组织表达Rap1b,在糖尿病状态下大鼠肾脏表达ROS明显升高,同时伴有肾小管Rap1b的表达显著增高。但具体机制尚不明确。本研究旨在初步探讨糖尿病肾病患者肾脏Rap1b的表达情况,为进一步研究其在糖尿病肾病发病过程中的作用提供实验依据。基于以上分析,我们认为Rap1b可能与糖尿病肾病小管上皮细胞线粒体氧化损伤及细胞凋亡的产生有关,为此,本实验开展如下的研究。第一章Rap1b在糖尿病肾病患者肾组织中的表达及其与肾问质纤维化的关系目的观察糖尿病肾病患者肾组织中Rap1b的表达,初步探讨Rap1b与糖尿病肾病肾间质纤维化的关系。方法随机选取经临床和肾脏病理确诊为糖尿病肾病及微小病变患者（原发性肾病）各6人。采用Masson、PASM、PAS染色观察肾脏普通病理改变；免疫组化检测肾脏组织Rap1b表达变化。结果肾脏普通病理结果显示肾活检组织呈典型的糖尿病结节性硬化样改变：肾小球系膜基质中-重度增生,多个节段呈结节状硬化,基底膜弥漫性或节段性增厚僵硬,部分节段毛细血管袢扩张,多灶性肾小管萎缩并伴部分小管代偿性扩张,肾间质多灶性纤维化；对照组患者可见系膜细胞及基质仅节段性轻度增生,基底膜不厚,个别肾小管上皮细胞颗粒样变性,肾间质和肾血管未见明显异常。糖尿病肾病患者肾小管间质损伤程度明显高于对照组。免疫组化显示：对照组患者肾小管上皮细胞有明显的Rap1b表达；而糖尿病肾病患者Rap1b表达上调,尤其在肾小管上皮细胞萎缩及发生肾间质纤维化的区域。结论糖尿病肾病患者肾组织,特别是肾小管,Rap1b表达上调；Rap1b表达上调的同时伴有肾小管间质损伤,提示Rap1b可能与糖尿病肾病肾间质纤维化有关。第二章Raplb通过线粒体途径调控高葡萄糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡目的探讨高葡萄糖对肾小管上皮细胞线粒体氧化应激的损伤机制,以及肾小管上皮细胞Raplb蛋白对高糖诱导的线粒体氧化损伤的保护作用。方法用不同浓度D-葡萄糖（5.5mM, 10mM,20mM,30mM）处理正常人近端肾小管上皮细胞株（D-甘露醇作为等渗对照组）,在不同时间点提取细胞mRNA和蛋白,通过细胞免疫荧光以及WesteM blot检测高糖对Rap1b蛋白的影响。通过Mito SOX荧光染色、线粒体呼吸链复合物活性检测、线粒体ATP检测、线粒体抗氧化酶活性检测及Real-time PCR,评价高糖对线粒体相关功能的抑制作用。通过细胞免疫荧光以及Westem blot检测高糖对小管上皮细胞的caspase-9、caspase-3的表达以及细胞凋亡的影响。质粒转染cDNA3.1/Rap1b质粒及两个失活性的Rap1b真核表达质粒（Rap1bS17N,第17位丝氨酸突变为天门冬氨酸；Rap1bT61R,第61位苏氨酸突变为精氨酸）使HK2细胞过表达Rap1b,观察Rap1b对高糖诱导的上述指标的变化。结果HK-2细胞中高糖导致Rap1b蛋白表达明显下降,尤其是Rap1bGTP呈浓度及时间依赖模式；等渗对照组Rap1b表达与正常对照组比较无显著性差异。HK-2细胞经30mM葡萄糖处理后,高糖诱导线粒体呼吸链活性受抑,ATP生成减少,抗氧化酶GSH Px及CAT的活性受抑,MnSOD2的mRNA水平表达升高,线粒体ROS的生成增加,procaspase-9、procaspase-3的表达下降,细胞发生细胞凋亡。而过表达Rap1b蛋白表达,可以逆转上述高糖诱导的线粒体的氧化应激损伤以及细胞凋亡。结论Rap1b可以特异性逆转高葡萄糖诱导的线粒体呼吸链活性受抑、ATP生成减少以及抗氧化酶的活性受抑,进而抑制线粒体ROS的生成增加,促进清除,保护细胞,减轻氧化应激引起的细胞凋亡的发生。第三章Rap1b通过调节线粒体动力蛋白及线粒体生源基因表达介导高葡萄糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡的调控目的探讨Rap1b蛋白对高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤及凋亡的作用机制。方法常规培养正常人近端肾小管上皮细胞株（HK-2）, cDNA3.1/Rap1b质粒转染HK-2细胞,建立稳定表达的细胞株。采用realtime-PCR及Westem blot检测线粒体融合分裂蛋白Drp-1 Mfn2以及线粒体生源基因PGC-1αNRF-1的mRNA水平及蛋白水平的表达。结果过表达的Rap1b可以特异性的明显下调高糖诱导的Drp-1的mRNA及蛋白的表达水平的升高,上调Mfn2的表达水平,逆转上述高糖诱导的线粒体融合分裂的失衡状态,加强线粒体融合与分裂过程的协调性。不仅如此,过表达的Rap1b还可以特异性上调由于高糖诱导的线粒体生源基因PGC-1α、NRF-1的表达下降。结论Rap1b可能通过调节PGC-1α以及NRF等线粒体生源基因,稳定线粒体融合分裂蛋白的平衡,保护高糖诱导肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡。
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