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F18大肠杆菌群体感应基因luxS功能研究

2020-12-12阅读(350)

F18大肠杆菌群体感应基因luxS功能研究

论文摘要

F18大肠杆菌是引起仔猪水肿病和仔猪腹泻的主要病原菌,而仔猪水肿病和仔猪腹泻是危害养猪业的重要疾病。F18大肠杆菌的致病性与其毒力因子密切直接相关,而这些毒力因子共同作用于宿主机体,发挥毒力致病作用,造成机体损害。毒力因子受到严格调控,而群体感应系统参与了这一调控过程。本试验研究探索了F18大肠杆菌F18ab参考株107/86株群体感应系统及luxS基因介导的相关功能。在细菌生长过程中,能够释放特定信号分子,使细菌可以感知周边环境中的同类数量,以此来调节自身多种基因的表达,这种现象称为群体感应（Quorum Sensing）,而这类信号分子称为自体诱导子（Autoinducer,AI）。在Ⅱ型群体感应系统中,lμxS和pfs两基因是重要相关基因,在AI-2合成中起着重要作用。为了验证F18大肠杆菌107/86参考株中是否存在Ⅱ型群体感应系统,根据GenBank中已经报道的E. coli K12株luxS和pJs基因序列,设计出相应引物对,成功扩增出107/86参考株的luxS和pfs基因,测序后发现与K12株序列有高度同源性,从而证明107/86株可能存在群体感应Ⅱ型系统。鉴于AI-2分子可以诱导报告菌BB170发生生物发光反应并能定量分析检测AI-2分子表达水平,利用这种方法同样检测出107/86株培养上清能够诱导生物发光实验,而大肠杆菌工程菌DH5a培养上清不能诱导生物发光,从而证明107/86株能够合成AI-2分子,存在群体感应Ⅱ型系统,而DH5a不能合成AI-2分子和群体感应Ⅱ型系统。为了进一步验证luxS基因在AI-2合成中的作用,利用限制性内切酶双酶切技术将luxS基因连接入pBR322质粒,构建成互补质粒,转化入群体感应系统阴性菌DH5a,发现其获得一定程度的AI-2合成能力和诱导B13170生物发光的能力。在pH7.5和37℃时,107/86株AI-2分子达到最高表达水平,pH或温度的提高或降低都会使得AI-2表达水平下降。培养基中加入0.5%葡萄糖,可使107/86株AI-2表达水平增加一倍,而在培养基中加入0.5%氯化钠和蔗糖并不能诱导细菌产生这种现象。对数生长期时107/86株AI-2水平迅速上升,但一旦进入稳定期,AI-2水平迅速下降。通过对大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌、多杀性巴氏杆菌等细菌的LuxS蛋白氨基酸序列进行比对分析,发现LuxS蛋白在上述不同种属细菌中具有相当高的同源性,从而在序列同源性上验证了群体感应Ⅱ型系统属于种问系统,即不同种属细菌分泌的AI-2分子可以对其他种属细菌进行调控。基于大肠杆菌F18ab107/86株luxS基因的已知序列,本试验对luxS基因采用RED同源重组技术进行了敲除。首先合成一对引物（每一条引物5’端与luxS基因同源,而3’端与pKD3质粒带有的氯霉素抗性基因cat同源）,从而得到了具有氯霉素抗性基因并带有同源臂的PCR产物,然后转化入大肠杆菌F18ab107/86株中,利用Red重组系统中的pKD46表达的三种重组酶,氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧的luxS基因同源序列与大肠杆菌染色体上的基因发生同源重组,通过氨苄青霉素和氯霉素双抗性LB平板筛选得到阳性一次重组菌,转化编码Flp重组酶进行专一性FRT位点重组的质粒pCP20,得到二次重组菌并去除了抗性筛选基因,结合PCR扩增和测序结果,证明luxS基因缺失株107/86△luxS的正确构建。上述缺失株的成功构建,为进一步深入研究群体感应系统与机体毒力因子相互作用的分子机制,细菌的致病机理及对国内仔猪水肿病的防控策略奠定了一定的基础。为了进一步研究群体感应系统对大肠杆菌毒力因子的调控,我们将表达luxS基因的pBR322质粒转化入缺失株107/86△luxS,构建了互补株,以野生株、缺失株、互补株的体系对luxS基因功能进行研究。互补株的上清可以诱导BB170生物发光,证明互补株确实恢复了AI-2活性。通过生长曲线,发现野生株在对数期的生长速率略高于缺失株和互补株。野生株、缺失株、互补株在IMVIC生化试验、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖等糖分解利用上并无定性差异。F18大肠杆菌通过F18菌毛等粘附素粘附于肠上皮细胞,进行定居增殖,菌毛是F18大肠杆菌首要毒力因子。试验表明,缺失株对猪小肠上皮细胞系IPEC-J2的粘附能力比起野生株和互补株有所下降,约37%。Stx2e是F18大肠杆菌的重要毒力因子,通过与肠上皮细胞Gb5受体结合,诱导细胞病变,而Vero细胞对Stx2e毒素敏感。通过结晶紫法定量检测Stx2e毒素作用后残存细胞,发现将缺失株分泌的Stx2e毒素加入Vero细胞后,残存的Vero细胞数量相比野生株和互补株提高约20%。外膜蛋白位于革兰氏阴性菌外膜表层,在维持细菌生理功能方面起着重要作用。本研究利用Triton X-114法提取野生株、缺失株、互补株的外膜蛋白。缺失株的外膜蛋白SDS-PAGE条带没有明显差异,用BCA法对外膜蛋白进行定量,发现缺失株外膜蛋白的产量仅有野生株和互补株的三分之二。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 符号说明
  • 上篇 文献综述
  • 第一章 F18大肠杆菌致病机理研究进展
  • 1.1 断奶仔猪水肿病（porcine edema disease,ED）
  • 1.2 仔猪水肿病大肠杆菌的毒力相关因子
  • 1.2.1 F18ab菌毛
  • 1.2.2 Stx2e毒素
  • 1.2.3 外膜蛋白（Outer Membrane Protein,OMP）
  • 参考文献
  • 第二章 群体感应系统研究进展
  • 2.1 Ⅰ型群体感应系统
  • 2.1.1 AI-1分子的信号转导
  • 2.2 LuxS/AI-2介导的Ⅱ型群体感应系统
  • 2.2.1 AI-2分子的生物合成
  • 2.2.2 AI-2的信号传导通路
  • 2.2.3 QSⅡ型系统的节
  • 2.2.4 AI-2的检测
  • 2.3 群体感应系统的生物功能
  • 2.4 群体感应系统对大肠杆菌基因的调控
  • 2.5 研究目的
  • 参考文献
  • 第三章 Red同源重组技术研究进展
  • 3.1 Red重组系统的结构以及机制
  • 3.2 四种Red重组系统类型
  • 3.3 Red重组系统的应用
  • 3.3.1 对位于染色体上的目标基因进行修饰改造
  • 3.3.2 对位于质粒的DNA序列进行靶向修饰改造
  • 3.4 Red同源重组的应用前景
  • 参考文献
  • 下篇 试验研究
  • 第四章 F18大肠杆菌luxS基因克隆分析以及AI-2信号分子表达水平的检测
  • 摘要
  • Abstract
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 菌株与质粒
  • 4.1.2 主要试剂
  • 4.1.3 主要仪器
  • 4.1.4 基因扩增
  • 4.1.5 大肠杆菌F18ab107/86株信号分子AI-2检测
  • 4.1.6 不同种属细菌LuxS蛋白氨基酸序列的比对
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 基因的PCR扩增和克隆
  • 4.2.2 测序结果与序列分析
  • 4.2.3 大肠杆菌F18ab107/86株的AI-2检测
  • 4.2.4 检测luxS对AI-2表达的作用
  • 4.2.5 葡萄糖、蔗糖、氯化钠对F18ab107/86菌株AI-2表达水平的影响
  • 4.2.6 pH值对F18ab107/86菌株AI-2表达水平的影响
  • 4.2.7 不同温度对大肠杆菌F18ab107/86株AI-2表达水平的影响
  • 4.2.8 细菌不同生长阶段对AI-2表达水平的影响
  • 4.2.9 不同种属细菌LuxS蛋白氨基酸序列的比对
  • 4.3 讨论
  • 参考文献
  • 第五章 F18大肠杆菌107/86株luxS基因缺失株的构建
  • 摘要
  • Abstract
  • 5.1 质粒与菌株
  • 5.2 培养基与主要试剂
  • 5.3 主要仪器
  • 5.4 技术方法
  • 5.4.1 PCR引物的设计
  • 5.4.2 融合PCR产物的制备和纯化
  • 5.4.3 感受态细胞的制备及转化
  • 5.4.4 Red重组功能的诱导和感受态细胞的制备
  • 5.4.5 电转化
  • 5.4.6 消除质粒pKD46
  • 5.4.7 一次同源重组菌△luxS：：Cat的PCR鉴定
  • 5.4.8 第二次重组菌107/86/△luxS的鉴定
  • 5.5 结果
  • 5.5.1 PCR鉴定缺失株
  • 5.5.2 引物LuxS F、LuxS R扩增107/86△luxS菌株的序列分析
  • 5.6 讨论
  • 参考文献
  • 第六章 F18大肠杆菌luxS功能分析
  • 摘要
  • Abstract
  • 6.1 材料与方法
  • 6.1.1 质粒与菌株
  • 6.1.2 常用试剂
  • 6.1.3 仪器
  • 6.1.4 lμxS缺失株生物性特性分析
  • 6.2 结果
  • 6.2.1 构建互补株
  • 6.2.2 生长曲线
  • 6.2.3 AI-2表达差异
  • 6.2.4 生化试验
  • 6.2.5 细胞粘附实验
  • 6.2.6 Stx2e毒素定量试验
  • 6.2.7 外膜蛋白SDS-PAGE
  • 6.2.8 外膜蛋白定量分析
  • 6.3 讨论
  • 参考文献
  • 致谢

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