水稻黄单胞菌双精氨酸运输（Tat）系统关键基因的克隆与功能分析

论文摘要

水稻黄单胞菌包含两个致病变种Xanthomonas orzae pv.oryzae（Xoo）和X.oryzaepv.oryzicola（Xooc）,在水稻上分别引起白叶枯病和细菌性条斑病。在本研究中,我们鉴定了水稻白叶枯病菌PXO99菌株和水稻条斑病菌RsGD42菌株的双精氨酸运输（Tat）途径,明确了Tat系统对这两种植物病原菌在游动性,趋化性,胞外多糖和毒力方面的影响。（一）根据GeneBank数据库中Xoo KACC10331和MAFF311018的tat基因序列设计引物,采用PCR方法从Xoo PXO99中克隆了tat同源基因,命名为tatXoo。通过同源重组的方式成功构建了PXO99菌株tatB和tatC基因的插入突变体,经PCR和Southern杂交验证确认。野生型菌株PXO99细胞在0.3%NA软琼脂平板上具有强游动性。而tatB和tatC基因突变体游动性削弱。而且,tatB和tatC基因突变体细胞缺失了鞭毛,并且在有氧条件下都不能对葡萄糖产生趋化应答。这表明,Tat分泌系统与鞭毛的形成和趋化性应答相关。同时tatB和tatC基因突变体减少了胞外多糖的分泌量。另外,与野生型菌株PXO99相比,tatB和tatC基因突变体都极大削弱了在水稻上的毒力。然而,两种突变体仍然能激发非寄主烟草的过敏性反应。结果显示,Tat系统对水稻白叶枯病菌在水稻上的致病力起重要作用。（二）根据水稻黄单胞菌tat基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻条斑病菌中克隆了tat同源基因,命名为tatXooc。通过同源重组构建了RsGD42的tatC基因突变体,经PCR和Southern杂交验证确认。与野生型菌株RsGD42相比,tatC基因突变体并不影响正常生长,并且仍可激发非寄主烟草的过敏性反应。有趣的是,tatC基因突变体缺失鞭毛,极大减弱了游动性。此外,在有氧条件下,该突变体对葡萄糖几乎不产生趋化性应答。明显地,与野生型菌株相比,tatC突变体减少了胞外多糖的分泌量,并且显著削弱了在成熟期水稻上的毒力。结果显示,水稻条斑病菌的Tat系统对其在水稻上的致病力起重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 水稻黄单胞菌致病机理研究进展
• 1 水稻黄单胞菌概述
• 2 植物病原细菌致病相关基因
• 3 黄单胞菌的主要致病生化因子
• 3.1 多糖
• 3.2 毒素
• 3.3 胞外酶
• 3.4 依赖于hrp基因的效应分子
• 3.5 依赖于asp基因的效应分子
• 3.6 生长激素
• 4 水稻白叶枯病菌的基因组结构
• 5 基因的水平转移与病原菌的进化
• 6 病原菌致病生化因子的调控
• 6.1 双组分调控系统
• 6.2 σ因子
• 6.3 群体感应调节系统（Quorum-sensing）
• 第二章 双精氨酸蛋白运输系统的研究进展
• 1 Tat系统信号肽
• 2 Tat系统的底物蛋白质
• 3 Tat系统组分
• 4 功能与应用
• 第二部分 研究内容
• 第一章 水稻白叶枯病菌tatB和tatC基因的克隆及功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 细菌基因组DNA的提取
• 1.4 质粒的提取
• 1.5 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算
• 1.6 DNA酶切、连接和PCR扩增产物回收
• 1.7 质粒的转化
• 1.8 Southern杂交
• 1.9 PCR反应
• 1.10 整合突变体的构建
• 1.11 互补菌株的构建
• 1.12 胞外纤维素酶的检测
• 1.13 铁载体（siderophore）的检测
• 1.14 生物膜的检测
• 1.15 胞外多糖（EPS）的检测
• 1.16 游动性和趋化应答试验
• 1.17 细胞形态和鞭毛观察
• 1.18 HR和致病性的测定
• 1.19 总RNA的提取及RT-PCR扩增
• 1.20 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 tat,tatB和tatC基因的克隆
• 2.2 tat基因的序列分析
• 2.3 tatB和tatC突变株的构建
• 2.4 TBM和TCM互补菌株的构建
• 2.5 tatB和tatC基因的突变不影响Xoo正常生长
• 2.6 tatB和tatC基因突变后不影响胞外纤维素酶的产生
• 2.7 tatB和tatC基因突变后不影响细菌铁载体（siderophore）的产生
• 2.8 tatB和tatC基因与白叶枯病菌生物膜的形成无关
• 2.9 tatB和tatC基因的突变改变细胞形态
• 2.10 tatB和tatC基因突变后影响胞外多糖（EPS）的产生
• 2.11 tatB和tatC基因对Xoo游动性和鞭毛形成很重要
• 2.12 tatB和tatC突变体丧失趋化性
• 2.13 tatB和tatC基因突变影响Xoo致病性,但不影响过敏性反应
• 2.14 RT-PCR检测结果
• 3 讨论与结论
• 3.1 Tat系统可能与胞外多糖产生相关
• 3.2 Tat系统可能与水稻白叶枯病菌鞭毛形成,游动性和趋化性相关
• 3.3 Tat系统与水稻白叶枯病菌致病性相关,但不影响过敏性反应
• 第二章 水稻条斑病菌tatC基因的克隆与功能验证
• 1 材料与方法
• 1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 细菌基因组DNA、质粒的提取
• 1.4 质粒的转化
• 1.5 Southern杂交
• 1.6 整合突变体的构建
• 1.7 互补菌株的构建
• 1.8 胞外纤维素酶的检测
• 1.9 铁载体（siderophore）的检测
• 1.10 生物膜的检测
• 1.11 胞外多糖（EPS）的检测
• 1.12 游动性和趋化应答试验
• 1.13 细胞形态和鞭毛观察
• 1.14 HR和致病性的测定
• 1.15 总RNA的提取及RT-PCR扩增
• 1.16 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 tat和tatC基因的克隆
• 2.2 tat基因的序列分析
• 2.3 tatC突变株的构建
• 2.4 XTCM互补菌株的构建
• 2.5 tatC基因的突变不影响Xooc正常生长
• 2.6 tatC基因突变后不影响胞外维素酶的产生
• 2.7 tatC基因突变后不影响细菌铁载体（siderophore）的产生
• 2.8 tatC基因的突变不影响条斑病菌生物膜的形成
• 2.9 tatC基因的突变改变细胞形态
• 2.10 tatC基因突变后影响胞外多糖（EPS）的产生
• 2.11 tatC基因对Xooc游动性和鞭毛形成很重要
• 2.12 tatC突变体丧失趋化性
• 2.13 tatC基因的突变影响Xooc致病性,但不影响过敏性反应
• 2.14 RT-PCR检测结果
• 3 讨论与结论
• 3.1 Tat系统可能与胞外多糖产生相关
• 3.2 Tat系统可能与鞭毛形成,游动性和趋化性相关
• 3.3 Tat系统与条斑病菌致病性相关,但对过敏性反应没有影响
• 第三章 水稻白叶枯病菌hisF基因的克隆及功能初析
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 细菌基因组DNA、质粒的提取
• 1.4 酶切、连接
• 1.5 质粒的转化
• 1.6 Southern杂交
• 1.7 整合突变体的构建
• 1.8 互补菌株的构建
• 1.9 突变体在MMX中的生长情况测定
• 1.10 HR和致病性的测定
• 1.11 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 hisF基因的克隆
• 2.2 hisF基因的序列分析
• 2.3 hisF突变株的构建
• 2.4 HFM互补菌株的构建
• 2.5 hisF基因的突变影响细菌的正常生长
• 2.6 hisF基因突变不影响细菌致病性
• 2.7 hisF基因与胞外纤维素酶的关系
• 3 讨论与结论
• 下一步工作设想
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 参考文献
• 致谢