论文摘要
背景和目的：机体的免疫反应在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）致病中起重要作用,阐明H. pylori感染的免疫致病机制对于H. pylori相关性疾病的防治具有十分重要的意义。辅助性T细胞（T helper, Th）免疫反应在H. pylori感染的免疫致病中起重要作用。但是H. pylori感染究竟通过何种机制影响Th反应,目前尚不清楚。T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子（T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule, Tim）是新近发现在T细胞表面的跨膜蛋白家族,它在CD4+T细胞分化成Thl和Th2细胞,及调控效应T细胞的免疫反应中起重要作用。Tim-3是Tim家族中的重要成员,它表达在分化成熟的Thl细胞表面,调节不同Th细胞亚群的功能,并影响调节性T细胞（Regulatory T cell, Treg）和Toll样受体（Toll like receptor, TLR）信号通路。H. pylori感染对Tim-3的影响目前尚不清楚。为此本研究在体内外观察了H. pylori感染后Tim-3的表达,及其与Thl和Th2免疫反应的关系,旨在初步探讨H. pylori感染影响Th反应的机制,为后续以Tim-3为靶点防治H. pylori感染和H. pylori相关性疾病提供理论和实验依据。方法：（1）H. pylori活菌与小鼠脾淋巴细胞共培养：以不同浓度的悉尼1号（Sydney Strain 1, SS1）H.pylori活菌与原代分离的BALB/c小鼠脾淋巴细胞共培养12h,细菌与细胞数之比分别为0 CFU:1（对照组）、100 CFU: 1（实验组A）、400 CFU:1（实验组B）和700 CFU: 1（实验组C）。（2）小鼠H. pylori感染模型建立：10只6-8周龄的清洁级的BALB/c小鼠,给予含1.0×109/ml的SS1 H.pylori活菌液,0.5ml/只,灌胃,隔日一次,共5次。末次灌胃后12周后处死小鼠,取胃黏膜进行H. pylori和病理学检测,确定模型建立后,取标本待测。另取10只小鼠不给予H. pylori,作为正常对照组。（3）各项指标检测：①胃黏膜内H. pylori的检测:采用改良Giemsa染色和H. pylori培养；②H. pylori作用小鼠淋巴细胞上清和胃黏膜内IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ含量的检测：采用双抗体夹心ELISA法；③胃粘膜及淋巴细胞内Tim-3、Foxp3、MyD88蛋白的检测：采用Western blot。研究结果：（1）H. pylori对小鼠淋巴细胞Tim-3及Th免疫反应的影响①H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞12h后显著上调小鼠淋巴细胞内Tim-3、MyD88蛋白表达（P<0.005）,各实验组Tim-3蛋白表达显著高于对照组（P<0.005）。实验组B和C MyD88蛋白表达显著高于对照组（P<0.05）;实验组A MyD88蛋白表达与对照组无显著差异（P>0.05）。Foxp3蛋白表达在各实验组和对照组无显著差异（P>0.05）。②H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞12h后对IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ含量均有显著影响（P<0.001,0.05）,各实验组培养上清中IL-4和IL-10含量均显著低于对照组,并随着H. pylori活菌数增加,IL-4和IL-10含量逐渐降低（P<0.001,0.005,0.05）；各实验组培养上清中IL-12和IFN-γ含量均显著高于对照组（P<0.005,0.05）,且实验组B和C显著高于实验组A（P<0.001）；各实验组和对照组培养上清中IL-2含量无显著差异（P>0.05）。（2）H. pylori感染对小鼠胃黏膜内Tim-3及Th反应的影响①H. pylori感染小鼠胃粘膜内Tim-3、MyD88和Foxp3蛋白表达均显著高于正常对照组（P<0.01,0.05）。②胃黏膜内IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量在对照组和H. pylori感染组之间均有显著差异（P<0.01,0.05）,Thl细胞因子IL-12和IFN-γ含量在H. pylori感染组均显著高于正常对照组（P<0.005,0.05）,Th2细胞因子IL-4和IL-10含量在H. pylori感染组均显著低于正常对照组（P<0.01,0.05）。③在H. pylori感染组,小鼠胃粘膜内Tim-3蛋白的表达与胃黏膜内Th2细胞因子IL-4和IL-10含量呈显著负相关（Rs=-0.922和-0.954,P<0.05）,与Th1细胞因子IFN-γ和IL-12含量呈显著正相关（Rs=0.902和0.933,P<0.05）；在正常对照组Tim-3蛋白的表达与胃黏膜内IL-4、IL-10、IFN-y和IL-12含量无显著相关性（Rs=-0.727,-0.531,0.746和0.630,P>0.05）。④在H. pylori感染组,小鼠胃粘膜内Tim-3蛋白表达与MyD88蛋白表达呈显著正相关（Rs=0.905,P<0.05）,与Foxp3蛋白表达无显著相关（Rs=0.723,P>0.05）；在正常对照组Tim-3蛋白表达与MyD88和Foxp3蛋白表达无显著相关性（Rs=0.819和0.508,P>0.05）。结论（1）H. pylori在体内外均可上调Tim-3的表达,促进Thl细胞分泌IL-12、IFN-γ等细胞因子,抑制Th2细胞分泌IL-4、IL-10细胞因子,提示它可抑制T淋巴细胞向Th2细胞分化,促进T淋巴细胞向Th1细胞分化,诱导Th1优势的免疫反应。（2）H. pylori感染小鼠胃黏膜内Tim-3表达与Thl细胞因子含量呈正相关,与Th2细胞因子含量呈负相关,说明H. pylori感染时Tim-3表达能较好的反映Th免疫反应；同时也与胃黏膜内TLRs信号通路中的关键分子MyD88蛋白的表达呈正相关,提示二者之间可相互调控,共同参与H. pylori的致病。
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