金鱼（Carassius auratus）卵黄原蛋白mRNA特性及其在环境雌激素筛选中的应用

论文摘要

卵黄原蛋白（Vitellogenin,VTG）是检测水环境雌激素的重要生物标志物。雄性鱼类VTG mRNA是一种检测环境雌激素的新兴生物标志物。我国水环境生物监测主要采用传统的群落学方法和生物化学检测,应用分子生物学方法检测水环境雌激素的报道较少。久效磷（Monocrotophos, MCP）是一种常用的有机磷农药,已经在我国造成了严重的农药残留污染。本文选用在我国广泛分布的鱼类——金鱼作为模式生物,研究久效磷对雄性金鱼VTG mRNA表达的影响。实验室邴欣等已成功分离纯化17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）暴露的雄性金鱼血清VTG;用非变性聚丙烯酰胺电泳（PAGE）测得VTG的分子量约为440kDa;用Western-blot技术证明在0.01 mg·L-1、0.10 mg·L-1、1.00mg·L-1三个久效磷浓度暴露组都能够诱导雄性金鱼分泌VTG。基于实验室已经完成的工作,本文采用RT-PCR检测金鱼VTG mRNA的表达,克隆编码金鱼VTG蛋白的部分cDNA片段,并以此为模板制备地高辛标记的RNA探针,用这种分子生物学技术检测环境雌激素对金鱼的雌激素效应,建立了新的筛选环境雌激素的分子生物学方法。实验所用金鱼购自青岛南山花鸟市场,驯养两周后开始实验。取雌鱼肝脏提取总RNA,根据已知氨基酸序列的鱼种设计兼并引物,RT-PCR扩增金鱼VTG基因片段,得到一条1135bp的特异性条带。将所得DNA进行测序,其序列用NCBI的Blast进行比对。结果显示,扩增所得片段与鲤鱼（Cyprinus carpio）的同源性为94%,与金鱼（Carassius auratus）同源性为93%,与鲦鱼（Pimephales promelas）同源性为90%,并且在系统发生树中与金鱼最为接近,由此可以初步认为这段序列是编码金鱼VTG的基因序列。为了进一步验证这段序列就是编码金鱼VTG的基因序列,同时建立检测环境雌激素的新方法,将所得片段转入大肠杆菌进行增殖,提取质粒,内切酶SphⅠ将质粒线性化,纯化得到高纯的线性DNA。选取Sp6 RNA聚合酶,以DNA为模板合成DIG标记的cRNA探针。用所得探针（615bp）进行Northern杂交实验,结果显示,0.01 mg L-1、0.10 mg L-1和1.00 mg L-1三个久效磷浓度组表达了与每条鱼0.2μg的17-β雌二醇暴露的金鱼相同大小的VTG mRNA。证明鱼类在久效磷诱导下能够产生与内源雌激素刺激下相同的VTG基因,进一步验证了久效磷是一种环境雌激素。本实验建立了RT-PCR与Northern杂交相结合的以VTG mRNA为生物标志物的筛选环境雌激素的分子生物学方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 环境雌激素诱导鱼类卵黄原蛋白产生及其机制研究进展
• 1.1 卵黄原蛋白概述
• 1.2 诱导鱼类产生VTG 的环境雌激素
• 1.3 以VTG 为生物标志物的环境雌激素筛选方法
• 1.3.1 生化检测法
• 1.3.2 细胞培养
• 1.3.3 分子生物学检测法
• 1.4 环境雌激素诱导VTG 产生与结构的相关性
• 1.4.1 烷基酚类化合物
• 1.4.2 植物雌激素
• 1.4.3 合成雌激素
• 1.4.4 多氯联苯类化合物
• 1.4.5 邻苯二甲酸酯类化合物
• 1.5 VTG 产生及其诱导机制
• 1.5.1 直接与雌激素受体结合的诱导机制
• 1.5.2 间接与雌激素受体结合的诱导机制
• 1.6 研究展望
• 2 金鱼卵黄原蛋白 mRNA 特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 样本采集
• 2.1.5 RNA 提取
• 2.1.6 RNA 浓度测定和电泳检测
• 2.1.7 AMV-RT 反应体系
• 2.1.8 引物设计
• 2.1.9 PCR 反应
• 2.1.10 PCR 扩增条带的凝胶回收与测序
• 2.1.11 扩增片段的克隆
• 2.1.12 扩增cDNA 序列的特异性检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 电泳检测RNA 质量
• 2.2.2 金鱼肝脏VTG mRNA 特异性序列的克隆
• 2.2.3 金鱼肝脏扩增cDNA 片段特异性比对
• 2.3 讨论
• 3 久效磷对雄性金鱼VTG 的诱导
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 久效磷暴露实验
• 3.1.5 取样及样品处理
• 3.1.6 VTG 免疫印迹实验
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 4 久效磷诱导雄性金鱼 VTG mRNA 表达的检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 2 暴露实验'>4.1.4 MCP 和E₂暴露实验
• 4.1.5 取样及样品处理
• 4.1.6 久效磷和E2 暴露组金鱼肝脏总RNA 的提取
• 4.1.7 Northern-blot 检测久效磷暴露金鱼VTG mRNA 的表达
• 4.2 结果与分析
• 2 暴露组金鱼肝脏总RNA 的提取'>4.2.1 久效磷及E₂ 暴露组金鱼肝脏总RNA 的提取
• 4.2.2 质粒的提取
• 4.2.3 DNA 模板的获得
• 4.2.4 RNA 探针的地高辛标记
• 4.2.5 Northern blot 结果
• 4.3 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文