免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用

论文摘要

近几年来,随着饲养规模的扩大,禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症等肿瘤病的发病率越来越高,给养殖业带来巨大的经济损失,并且以前的流行病学调查发现,临床上三种肿瘤病的混合感染非常普遍,从而导致通过临床症状对这三种肿瘤病进行鉴别诊断非常困难,容易出现误诊。另外,目前该三种肿瘤病的实验室检测方法也存在许多不足之处。本研究结合免疫组织化学检测方法具有快速、特异性好、可鉴别诊断等优点,利用实验室保存的J亚群禽白血病病毒HN0001株、马立克氏病毒GX0101株和网状内皮组织增生症病毒SNV株分别攻毒1日龄SPF鸡,取攻毒后鸡的脏器,利用针对这三种病毒的单抗,分别建立这三种疾病的免疫组织化学检测方法;并且通过三种病毒共感染1日龄SPF鸡,对感染后不同周龄鸡的肝脏、肾脏和法氏囊等脏器进行HE染色和病理学观察,了解三种病毒共感染1日龄SPF鸡后不同脏器的动态病理学变化;同时通过免疫组化检测不同脏器内的病毒,研究三种病毒在不同脏器组织细胞内的动态分布,以及利用连续切片对病毒感染进行细胞定位,在同一视野下观察三种病毒是否能够感染同一个组织细胞。最后本研究利用建立的免疫组织化学方法,和特异性强的传统的病毒分离方法对来自北京、山东和河南部分养鸡场的肿瘤病死鸡进行了这三种病毒感染的调查,比较了两种检测方法在鸡肿瘤病诊断中的优缺点。1. J亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立1.1 J亚群禽白血病免疫组织化学检测方法的建立J亚群禽白血病病毒HN0001株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第4周鸡只开始出现死亡,通过利用该病毒传统的实验室诊断技术IFA实验验证了HN0001成功感染鸡只。同时取病死鸡的不同脏器制作石蜡切片后,通过对免疫组化的关键步骤:抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、DAB显色时间等条件的优化,成功建立了ALV-J免疫组织化学检测方法。结果发现抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液中92-98℃加热15min;过氧化氢消化为室温消化20-30min;DAB显色时间为室温下10min。ALV-J单克隆抗体JE9稀释比例为1:150,检测到的阳性染色主要出现在肝脏和法氏囊的胞核和胞浆中、脾脏的胞浆和肾脏的胞膜、胞浆中。1.2鸡马立克氏病免疫组织化学检测方法的建立马立克氏病病毒GX0101株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第5周开始出现死亡,也利用IFA实验验证了GX0101成功感染鸡只。通过对抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、显色时间等条件的优化,成功建立了MDV免疫组织化学染色方法。结果发现MDV单克隆抗体H19稀释比例为1:150,其它条件与ALV-J的方法一致;同时检测到阳性染色主要出现在肝脏、肾脏和法氏囊的胞核和胞浆、脾脏的胞浆中。1.3鸡网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立网状内皮组织增生症病毒SNV株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第4周开始出现死亡,也通过病毒分离实验验证了SNV株成功感染鸡只。同时也通过对抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、显色时间等条件的优化,成功建立了该病免疫组织化学染色方法。结果发现REV单克隆抗体11B118稀释比例为1:300,同样其他条件也与ALV-J的相同。可以从肝脏、肾脏、脾脏和法氏囊组织细胞的胞浆中观察到阳性染色。2.三种肿瘤病毒共感染SPF鸡的动态病理学观察本研究利用HN0001、GX0101和SNV株共感染1日龄SPF鸡,取感染后不同周龄鸡的脏器制作石蜡切片进行HE染色,了解三种病毒混合感染引起的鸡只不同脏器的动态病理学变化,同时利用建立的免疫组织化学方法研究三种病毒共感染鸡后在不同脏器组织细胞内的动态分布以及利用连续切片在同一视野下观察三种病毒能否感染同一组织细胞。三种病毒共感染1日龄SPF鸡后,每周剖杀3只鸡,取自然死亡和剖杀鸡只的肝脏、法氏囊和肾脏,制作石蜡切片,进行HE染色,观察其病理学变化,结果发现:肝脏:攻毒早期（1-42天）,肝细胞索并未消失,中期（42-120天）部分肝细胞索消失,到了攻毒晚期（120-180天）,肝细胞索基本全部消失。淋巴细胞浸润生长。随着肝细胞索的消失,肝脏上皮细胞胞核也发生溶解;肾脏:攻毒早期（1-42天）,肾小管上皮细胞萎缩,中期（42-120天）部分肾小管上皮细胞消失,到了攻毒晚期（120-180天）,大量上皮细胞发生崩解。法氏囊:攻毒后早期（1-42天）和中期（42-120天）,法氏囊滤泡未消失,滤泡髓质细胞部分发生崩解,攻毒晚期（120-180天）,法氏囊滤泡结构模糊,法氏囊滤泡髓质细胞几乎全部崩解。同时利用免疫组化方法检测三种病毒在感染后不同周龄鸡的脏器内分布发现,REV在感染后第7天首先在法氏囊被检测到;MDV和ALV-J在攻毒后第14天可以被检测到。对三种病毒在不同脏器内的动态分布研究发现:ALV-J阳性信号最早出现在肝脏中,随着感染日龄的增大,肝脏内阳性细胞的数量和阳性染色的深浅并没有发生显著变化,而法氏囊组织细胞内,随着日龄增大阳性细胞数量逐渐增多,染色也加深,肾脏中却是阳性细胞的数量变化不大,但是阳性染色随着感染日龄的增大而加深;REV阳性信号最早是出现在法氏囊中,并且随着感染日龄的增加,肝脏和法氏囊滤泡细胞和间质细胞内的阳性细胞数量发生一过性增多又降低,染色也是先加深又变浅,肾脏中阳性细胞数量和阳性染色随着感染日龄的增大而增加;MDV阳性信号与REV的一样,最早也是出现在法氏囊中,但是法氏囊滤泡细胞和间质细胞和肝脏内阳性细胞的数量随着感染日龄增加而增多,阳性染色深浅变化不大,而在肾脏中一直未发现阳性细胞。并且,阳性染色在细胞内出现的部位与单独感染时一致。利用连续组织切片,对三种病毒进行同视野观察发现,三种病毒共感染鸡后,可以共同感染脾脏和法氏囊的同一个组织细胞,还未发现可以感染肝脏和肾脏的同一组织细胞;而三种病毒可以感染同一只鸡的肝脏、脾脏和法氏囊,不能感染同一只鸡的肾脏,REV和ALV-J可以感染同一只鸡的肝脏、脾脏、肾脏和法氏囊组织。3.中国部分地区肿瘤病死鸡三种肿瘤病毒的感染情况调查本实验收集了来自我国北京、山东和河南部分地区肿瘤病死鸡91只,利用特异性较强的IFA和免疫组化方法检测了J亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症的感染情况,比较了两种检测方法的优缺点。调查结果表明,肿瘤病死鸡中ALV-J的单独检出率最高,尤以北京地区最高,而MDV单独检出率则相对较低,REV位于两者之间,说明目前危害家禽的肿瘤病仍然是以J亚群禽白血病为主;同时发现,三种病毒的混合感染也是较为普遍的,其中ALV-J和REV的混合感染最为普遍,其次是MDV和REV,混合感染率较低的是MDV和ALV-J。免疫组化检测方法不仅可以观察脏器的病理学变化,而且还可以利用不同的单抗对三种疾病进行鉴别诊断,在临床病例的诊断中,这两者的结合可以更加有力的对疾病进行判断。另外,通过对临床肿瘤病料的显微病理学观察和三种肿瘤病毒的免疫组化检测发现,ALV-J引起肿瘤类型越来越复杂多样,不仅仅局限于以前的髓细胞瘤和肾瘤等,近期还出现了血管瘤、纤维肉瘤等新的类型。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.1 禽白血病的研究进展
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 禽白血病病毒的细胞培养
• 1.1.3 流行病学
• 1.1.4 临床症状和病理变化
• 1.1.4.1 临床症状
• 1.1.4.2 病理变化
• 1.1.5 发病机理
• 1.1.6 禽白血病的诊断
• 1.1.7 禽白血病的预防和控制
• 1.1.7.1 加强种鸡群的监控
• 1.1.7.2 保持种鸡群对ALV 的高度洁净状态
• 1.1.7.3 强化弱毒疫苗中ALV 污染的检测和监控
• 1.2 马立克氏病的研究进展
• 1.2.1 病原学
• 1.2.2 流行病学
• 1.2.3 临床症状和病理变化
• 1.2.4 致病机理
• 1.2.4.1 病毒复制和早期溶细胞性感染期
• 1.2.4.2 潜伏感染期
• 1.2.4.3 转化和肿瘤形成
• 1.2.5 诊断技术
• 1.2.5.1 病毒分离
• 1.2.5.2 病毒抗原的检测
• 1.2.5.3 聚合酶链反应（PCR）技术
• 1.2.5.4 DNA 探针技术
• 1.2.5.5 病理学诊断
• 1.2.6 防治策略
• 1.3 网状内皮组织增生症的研究进展
• 1.3.1 病原学
• 1.3.2 流行病学
• 1.3.3 诊断技术
• 1.3.4 REV 感染的鉴别诊断
• 1.3.4.1 临床诊断
• 1.3.4.2 病毒分离与鉴定
• 1.3.4.3 血清学检测
• 1.3.4.4 病理学检查
• 1.3.4.5 鉴别诊断
• 1.3.5 防控策略
• 1.4 免疫组织化学技术
• 1.4.1 概念
• 1.4.2 免疫组织化学技术的分类
• 1.4.3 免疫组化的判断标准
• 1.4.4 免疫组织化学技术在人类肿瘤病理诊断中的应用
• 1.4.4.1 肿瘤的诊断与鉴别诊断
• 1.4.4.2 确定原发性肿瘤的组织来源和转移性恶性肿瘤的原发部位
• 1.4.4.3 对某类肿瘤进行进一步的病理分型
• 1.4.4.4 在肿瘤分期上的应用
• 1.4.4.5 发现微小病灶
• 1.4.4.6 为临床治疗方案的选择和肿瘤的预后提供依据
• 1.4.5 免疫组织化学技术在兽医学诊断中的应用
• 1.4.5.1 对组织中常规或特殊病原的检测
• 1.4.5.2 病原在机体的定位
• 1.4.5.3 病原在机体的动态分布研究
• 1.4.5.4 新病原的发现
• 1.4.5.5 活体动物中病原的检测
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 病毒及单抗来源
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.1.3 主要仪器
• 2.1.1.4 主要试剂的配制
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 J 亚群禽白血病免疫组化检测方法的建立
• 2.1.2.2 马立克氏病免疫组织化学检测方法的建立
• 2.1.2.3 网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立
• 2.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 病毒及单抗来源
• 2.2.1.2 主要试剂
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 病毒扩增
• 2.2.2.2 病毒的定量
• 2.2.2.3 实验动物及攻毒
• 2.2.2.4 病毒分离
• 2.2.2.5 石蜡切片的制备
• 2.2.2.6 HE（苏木精-伊红）染色
• 2.2.2.7 病理学观察
• 2.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.1.1 材料
• 2.3.1.1.1 病料来源
• 2.3.1.1.2 主要试剂
• 2.3.1.1.3 主要仪器
• 2.3.1.2 试验方法
• 2.3.1.2.1 病毒分离
• 2.3.1.2.2 石蜡切片的制备
• 2.3.1.2.3 HE（苏木精-伊红）染色
• 2.3.1.2.4 免疫组化检测
• 3 结果与分析
• 3.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立
• 3.1.1 J 亚群禽白血病免疫组化检测方法的建立
• 3.1.1.1 病毒扩增
• 3.1.1.2 病毒TCID50 的测定
• 3.1.1.3 实验动物及攻毒
• 3.1.1.4 间接免疫荧光（IFA）
• 3.1.1.5 免疫组织化学染色方法的建立
• 3.1.2 马立克氏病免疫组化检测方法的建立
• 3.1.2.1 病毒扩增
• 3.1.2.2 病毒的定量
• 3.1.2.3 实验动物及攻毒
• 3.1.2.4 间接免疫荧光（IFA）
• 3.1.2.5 免疫组织化学染色方法的建立
• 3.1.3 网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立
• 3.1.3.1 病毒扩增
• 3.1.3.2 病毒的定量
• 3.1.3.3 实验动物及攻毒
• 3.1.3.4 间接免疫荧光（IFA）
• 3.1.3.5 免疫组织化学染色方法的建立
• 3.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察
• 3.2.1 病毒扩增
• 3.2.2 病毒的定量
• 3.2.3 实验动物及攻毒
• 3.2.4 HE（苏木精-伊红）染色
• 3.2.5 病理学观察
• 3.2.5.1 三种病毒在组织细胞内的动态变化
• 3.2.5.2 三种病毒对同一组织细胞的感染情况
• 3.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查
• 3.3.1 病毒分离
• 3.3.2 HE（苏木精-伊红）染色
• 3.3.3 免疫组化检测
• 4 讨论
• 4.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立
• 4.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察
• 4.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文情况
• 博士学位论文内容简介及自评