南江黄羊MRF基因家族的分离克隆及其在肌肉组织中的表达规律研究

论文摘要

MRF基因家族在肌肉系统发育中扮演着关键的角色,它们精密调控肌肉细胞形成的起始、增殖、分化、融合和再生等过程。本研究以南江黄羊为实验材料,分别在出生后0d、15d、30d、60d、90d和120d时采取不同肌肉组织（半腱肌、半膜肌、背最长肌、股四头肌和臀中肌）。在肌肉组织中分离克隆得到山羊MRF基因家族四个基因的cDNA序列,然后使用实时荧光定量技术检测山羊MRF基因家族在不同肌肉不同发育阶段的相对表达量。结果表明：（1）成功克隆得到山羊MRF基因家族的四个基因序列,包括MyoD基因的一部分CDS区和.Myf5、Myf6、MyoG基因的全CDS区,其长度分别为551bp和960bp、837bp、856bp。其中CDS区长度分别为551bp、768bp、729bp、675bp。GenBank登录号分别为JF829004（Myf5）、HM204707（Myf6）、JF829005（MyoD）、JF829006（MyoG）。将四个基因序列与近源物种对比,发现它们的相似性都大于90%,说明MRF基因家族在不同物种间具有高度的保守性。（2）生物信息学分析发现,MRF家族基因编码的蛋白质都有较明显的亲水区,在N端都有可能存在信号肽。（3）通过Q-PCR得到MRF基因家族成员在6个时期和5个不同肌肉组织中的相对表达量。通过分析发现MRF基因家族表达不具有明显的性别差异,这表明在120d以前,性别对MRF基因的表达没有显著性差异。（4） Myf5、Myf6和MyoD基因在同时期的各组织中差异比较大,MyoG基因在半膜肌中表达量极显著（P<0.01）高于其它组织,而其它组织间无显著差异。（5）定量PCR检测MRF基因家族的表达规律变化情况。结果表明,Myf5基因的表达量峰值出现在15d和120d,而Myf6基因的表达峰值出现在90d。MyoD基因的表达峰值出现在0d,然后基因表达量下调并保持稳定。MyoG基因的表达在不同肌肉组织发育时期没有显著性差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 目录
• 1 综述
• 1.1 骨骼肌发育过程简介
• 1.1.1 肌细胞发育的早期分化阶段
• 1.1.2 肌细胞发育的成熟阶段
• 1.1.3 后期分化阶段
• 1.1.4 肌肉再生
• 1.2 生肌调节因子家族概况
• 1.2.1 MRF基因家族结构特点
• 1.3 MyoD研究进展
• 1.3.1 MyoD基因的结构和功能
• 1.3.2 MyoD基因的调控
• 1.3.3 MyoD基因型对动物生长性能的影响
• 1.3.4 MyoD表达与生产性能相关性研究
• 1.4 MyoG基因研究进展
• 1.4.1 MyoG基因的结构和功能
• 1.4.2 MyoG基因型与动物生长性能的影响
• 1.4.3 MyoG的表达与生产性能相关性研究
• 1.5 Myf5和Myf6基因研究进展
• 1.5.1 Myf5和Myf6基因的结构和功能
• 1.5.2 Myf5和Myf6基因型与动物生长性能的影响
• 1.5.3 Myf5和Myf6基因表达与生长性能相关性研究
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 主要试剂及配制
• 3.1.3 常用试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 总RNA的提取
• 3.2.3 总RNA检测
• 3.2.4 cDNA第一链的合成
• 3.2.5 PCR获得目的基因
• 3.2.6 PCR产物鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定
• 3.2.7 PCR产物胶回收纯化
• 3.2.8 克隆
• 3.2.9 测序与序列鉴定
• 3.2.10 实时荧光定量（Q-PCR）
• 3.3 数据分析
• 4 结果与分析
• 4.1 总RNA提取结果
• 4.2 反转录结果抽检
• 4.3 普通PCR扩增结果
• 4.4 克隆结果检测
• 4.5 测序结果和序列生物信息学分析
• 4.5.1 序列分析
• 4.5.2 MRF氨基酸组成特征
• 4.5.3 MRF编码蛋白疏水性分析
• 4.5.4 蛋白质二级结构预测
• 4.5.5 磷酸化位点分析
• 4.5.6 信号肽分析
• 4.5.7 糖基化位点预测
• 4.5.8 跨膜蛋白分析
• 4.6 荧光定量与结果分析
• 4.6.1 扩增曲线和标准曲线
• 4.6.2 MRF基因家族特异性表达性别差异分析
• 4.6.3 MRF基因家族时间特异性表达分析（不含性别因素）
• 4.6.4 MRF基因家族空间特异性表达分析（不含性别因素）
• 5 讨论
• 5.1 MRF基因序列分析和相应的氨基酸序列分析
• 5.2 MRF基因家族表达性别差异
• 5.3 MRF基因家族的发育性表达
• 5.4 MRF基因家族的组织特异性
• 5.5 MRF表达的规律与基因功能的关系
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献