论文摘要
槲皮素是黄酮类化合物中的重要一员,多以糖苷的形式存在于植物中。洋葱皮即含有丰富的槲皮素及其糖苷。而洋葱加工业在洋葱深加工过程中产生大量的洋葱皮废弃物,造成了环境污染和资源流失。大量研究已表明,槲皮素苷元的生物活性远远高于槲皮素糖苷。因此,将洋葱皮废弃物加以利用,并对槲皮素糖苷进行生物转化,具有重要的经济效益和环境效益。本论文选择洋葱皮废弃物为原料,利用耐热性β-葡萄糖苷酶并使其固定化后用于洋葱皮槲皮素糖苷的水解作用,使洋葱皮槲皮素糖苷转化为具有更高生物活性的槲皮素苷元,取代酸水解等易产生环境污染的生产模式,为洋葱皮资源利用提供一条绿色环保的生物转化途径。我们选择洋葱皮废弃物作为原材料,采用乙醇热抽提法从洋葱皮废弃物获得洋葱皮槲皮素糖苷,经HPLC分析检测后发现,洋葱皮提取液中槲皮素糖苷主要为槲皮素-3,4’-O-葡萄糖苷（QDG）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3G）、槲皮素-4’-O-葡萄糖苷（Q4G）三种,含量以Q4G为最高,其次为QDG,而Q3G最低；同时含有部分槲皮素苷元（Q）。以95%乙醇溶液于80℃条件下可对洋葱皮槲皮素及其糖苷进行较好的提取。采用来自嗜热厌氧乙醇杆菌Thermoanaerobacter etholicus JW200的p-葡萄糖苷酶（Te-BglA）和来自海栖热袍菌Thermotoga maritima的p-葡萄糖苷酶（Tm-BglA）及其突变酶N223S和G224T对槲皮素糖苷进行水解,水解产物经HPLC分析检测,结果表明Tm-BglA与Te-BglA均能高效水解槲皮素糖苷,且优先水解槲皮素4’位糖苷,而Tm-BglA比Te-BglA有更高的槲皮素糖苷水解效率；突变酶N223S与G224T较Tm-BglA水解Q3G的效率更高。采用重组蛋白质技术将突变酶N223S与G224T的C末端融合上亲和标签——几丁质结合域（Tt-ChBD）,与几丁质结合构建纯化固定化酶用于洋葱皮槲皮素糖苷的生物转化,结果表明：突变酶N223S与G224T的共固定化酶在pH 6.2,80℃,20 min条件下循环水解洋葱皮槲皮素糖苷,在第1批次中每1.0 g洋葱皮可生产Q达3.06 mg,QDG与Q4G得到了完全降解,仅有少量Q3G残留；连续反应至第20批次时可生产2.35 mg槲皮素,相对槲皮素产率达70%。以几丁质为载体进行固定化的耐热性β-葡萄糖苷酶应用于洋葱皮槲皮素糖苷的水解,实现洋葱皮槲皮素糖苷的生物转化是可行的。