Bt-CpTi抗虫基因对玉米的遗传转化

论文摘要

本研究以5 个东北主栽玉米自交系品种和2 个单交种的胚叶和幼胚为外植体诱导愈伤组织,探讨了影响植株再生及农杆菌介导法和电击法遗传转化效率的主要影响因素,建立了高效的玉米再生体系和稳定的遗传转化体系,获得了1 株PCR 检测阳性植株,初步证实Bt-CpTI双价抗虫基因已经整合到玉米基因组中。主要研究结果如下: 1.再生体系的建立⑴玉米胚性愈伤的产生受遗传因素的影响,不同基因型胚性愈伤诱导率差异很大。玉米胚叶愈伤组织的形成能力因其形态学部位的不同而呈显著差异,从基部向上依次递减。在供试的玉米基因型中,胚叶胚性愈伤诱导率以吉846、81162 较高,同时确定了切取玉米胚叶的最佳部位是从胚叶基部向上切取0.3cm 左右的小段诱导愈伤。而幼胚胚性愈伤诱导率以DH11、DH9、吉846、81162 较高。⑵不同基因型玉米诱导愈伤组织所需的最佳2,4-D浓度不同,对玉米胚叶诱导愈伤的分别是81162为2mg/L,吉846、农大178、K10为3mg/L,东8112为4mg/L。对玉米幼胚诱导愈伤的分别是K10为4mg/L,农大178、东8112、吉846、81162为3mg/L。⑶玉米不同基因型的不定芽分化率不同。愈伤组织分化培养基确定为:MB + 6-BA 1.0mg/L + KT 0.5mg/L。⑷再生芽生根培养基确定为:MB + IBA 2.0mg/L + NAA 0.5mg/L。并通过不断地改进玉米移栽培养条件,提高了再生苗的移栽成活率。2.遗传转化体系的建立⑴选择剂Geneticin（G418）浓度的确定确定了农杆菌遗传转化的抗性筛选剂为G418,筛选剂G418 的使用浓度在愈伤组织生长阶段为60mg/L,分化阶段为40mg/L。⑵农杆菌介导法对玉米胚性愈伤组织的遗传转化①愈伤组织的基因型不同,转化效果不同,通过检测GUS 瞬时表达率,确定了DH11、DH9、吉846 都是理想的转化受体材料。②探讨了影响遗传转化效率的4 个因素正交试验的较优组合为:预培养6d、侵染时间10min、共培养时间3d、共培养培养基葡萄糖浓度10g/L。4 个因素的影响程度依次为:共培养时间、侵染及共培养基中加葡萄糖浓度、侵染时间、预培养时间。⑶电击法对玉米胚性愈伤组织的遗传转化探讨了电击法电击参数对愈伤组织的伤害情况,确定了电击参数。电容为960μF,电场强度为375v/cm,电击时间为61ms 为合适的电击条件。3.转化体的PCR 检测

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 植物抗虫基因工程的研究进展
• 1.2.2 玉米遗传转化的研究进展
• 1.2.3 玉米转基因技术在育种中的应用
• 1.2.4 转基因玉米的安全性问题
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 外植体
• 2.1.3 农杆菌菌株及质粒
• 2.1.4 重要仪器设备
• 2.1.5 GUS 瞬时表达检测材料
• 2.1.6 PCR 检测材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 玉米胚叶再生体系的建立
• 2.2.2 玉米幼胚再生体系的完善
• 2.2.3 筛选剂G418 及其浓度的确定
• 2.2.4 农杆菌介导法对胚性愈伤组织的遗传转化
• 2.2.5 电击法对胚性愈伤组织的遗传转化
• 2.2.6 PCR 检测
• 2.2.7 数据统计分析方法
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米胚叶愈伤组织再生体系的建立
• 3.1.1 玉米胚叶形态学部位对愈伤组织形成的影响
• 3.1.2 基因型对愈伤组织形成的影响
• 3.1.3 2,4-D 浓度对愈伤组织诱导的影响
• 3 浓度对愈伤组织的影响'>3.1.4 AgNO₃浓度对愈伤组织的影响
• 3.1.5 愈伤组织分化不定芽和不定根的形成
• 3.2 玉米幼胚愈伤组织再生体系的完善
• 3.2.1 培养基对愈伤组织诱导的影响
• 3.2.2 2,4-D 浓度对愈伤组织诱导的影响
• 3.2.3 再生植株的驯化和移栽
• 3.2.4 玉米愈伤组织的蛋白质分析
• 3.3 农杆菌介导法对玉米的遗传转化
• 3.3.1 愈伤组织基因型对遗传转化的影响
• 3.3.2 遗传转化影响因素的正交试验
• 3.3.3 筛选剂G418 浓度的确定
• 3.4 电击法对玉米的遗传转化
• 3.4.1 电击条件对玉米胚性愈伤组织生长的影响
• 3.4.2 愈伤组织基因型对遗传转化的影响
• 3.5 转化植株的PCR 检测
• 4 讨论
• 4.1 影响玉米胚性愈伤组织形成的关键因素
• 4.1.1 外植体对胚性愈伤组织形成的影响
• 4.1.2 基因型对胚性愈伤组织形成的影响
• 4.1.3 激素对胚性愈伤组织形成的影响
• 4.1.4 培养基对胚性愈伤组织形成的影响
• 4.1.5 胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的蛋白质检测
• 4.2 提高玉米再生植株移栽的成活率
• 4.3 影响农杆菌遗传转化的因素
• 4.4 转化体的筛选
• 4.5 影响电击法遗传转化的因素
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 常用试剂的成分与配制
• 附录B 缩写词及英汉对照
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 图版