一、T细胞疫苗对HCV的清除作用（论文文献综述）
刘柯慧,王晖[1]（2021）在《从丙型肝炎疫苗研发看HCV感染后T细胞介导的免疫反应》文中提出丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝脏疾病发生和死亡的主要原因之一。全球有7 100万慢性丙型肝炎（CHC）患者,每年死于HCV感染相关疾病的人数不少于40万[1]。自HCV发现以来,关于其病毒学、免疫发病机制、治疗等方面的研究都取得了巨大进展。直接作用抗病毒药物（DAA）的研发和临床应用革新了CHC的治疗策略,持续病毒学应答率几乎达到100%[1]。然而,要实现世界卫生组织2030年全球性根除CHC这一目标,仍需要预防性疫苗。
郑智航[2]（2020）在《基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗》文中进行了进一步梳理寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是一种通过蚊媒传播的黄病毒,属于黄病毒科黄病毒属,在热带、亚热带地区广泛流行。自1947年在乌干达寨卡森林首次被发现以来,在全球范围内60多年都未曾爆发流行。2007年,ZIKV在太平洋西部的雅浦岛首次爆发后,引起了部分关注;但直到2015年南美洲ZIKV疫情爆发,才受到了国际社会的广泛关注。基于该病毒对全球公共卫生安全造成的重大威胁,2016年ZIKV感染被正式列为全球公共卫生紧急事件,针对它的研究也不断深入。ZIKV表面覆盖包膜,内部核衣壳组成二十面体结构,其基因组为大小约11kb的正义单链RNA。被ZIKV感染后,患者症状一般较轻,包括发热、斑疹、关节痛和结膜炎等,也有研究发现,它与神经系统疾病（如格林-巴利综合征）存在必要关联;更严重的是,先天性ZIKV感染可能导致严重的临床疾病,包括骨骼异常、眼睛视觉病变、小头畸形、脑积水等。ZIKV可能存在的垂直传播、性传播、血液传播等诸多传播途径,也导致ZIKV的防治更为艰难,更易造成严重的公共卫生危机。在ZIKV引起了国际社会的广泛关注后,其疫苗研发也进入了“快车道”。目前,正在研发的ZIKV疫苗种类主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、重组疫苗等。而这些正在研发的疫苗都专注于诱导中和性抗体的产生,抗体能够通过中和病毒颗粒近而抑制病毒的复制,但所产生的抗体虽然可能有保护性,但也可能导致病毒感染过程中的抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement,ADE）反应的发生。有实验证据显示,ZIKV的抗体能够在体外实验模型中协助登革病毒增强对机体或细胞的感染（ADE）,反之亦然。有报道发现ZIKV感染过程中的T细胞反应发挥着重要作用,ZIKV的记忆性CD4+和CD8+T细胞反应在动物模型中被证实具有针对ZIKV的保护作用,而T细胞反应本身没有ADE发生的可能性。本课题通过开发具有保护性,且无ADE风险的T细胞疫苗,研究T细胞疫苗预防病毒感染的可行性以及有效性,进而探究T细胞反应在ZIKV感染过程中所发挥的作用,以及T细胞疫苗在ZIKV感染过程中提供保护作用的机制。ZIKV T细胞表位的确定对T细胞疫苗及T细胞免疫研究有重要作用,因此本课题首先着重于在ZIKV感染小鼠中T细胞表位的确定。我们针对ZIKV的蛋白序列,设计并合成了427条重叠多肽,每条为18个氨基酸长,相邻多肽间重叠10个氨基酸,覆盖病毒蛋白序列全长。利用IFN-γELISPOT试剂盒,我们检测出了63条阳性肽段。通过FACS进一步分析不同T细胞亚群被ZIKV肽段刺激起的细胞因子分泌量,最终确定了11条包含CD4+T细胞表位的肽段,以及19条包含CD8+T细胞表位的肽段。其中7条肽段位于结构蛋白上,21条肽段位于非结构蛋白上。为了聚焦T细胞疫苗、避免抗体反应的干扰,我们利用从非结构蛋白中选择的包含T细胞表位的肽段构建了3种ZIKV T细胞疫苗,包括仅含CD4+T细胞表位的肽段NS2A（95-112）,NS2B（13-30）,NS2B（37-54）,NS2B（93-110）,NS3（43-60）。仅含CD8+T细胞表位的肽段NS1（263-280）,NS4A（66-83）,NS4B（36-53）,NS4B（76-93）,NS4B（84-101）,以及包含CD4+T细胞表位肽段NS2A（95-112）,NS2B（13-30）,NS2B（37-54）,NS2B（93-110）,NS3（43-60）与包含CD8+T细胞表位肽段NS1（263-280）,NS4A（66-83）,NS4B（36-53）,NS4B（76-93）,NS4B（84-101）的混合。然后我们通过ZIKV感染免疫后的小鼠以验证三种ZIKV T细胞疫苗的保护效果,发现三种ZIKV T细胞疫苗都能给被感染的小鼠提供保护,且同时包含CD4+与CD8+T细胞表位肽段疫苗能提供最佳保护。我们也同时发现ZIKV T细胞疫苗对于清除眼睛、脾脏、肝脏组织内的病毒有很好的效果。通过中和实验、ADE实验,我们确认利用这些T细胞表位肽段进行多次免疫后,在急性感染期既没有中和性抗体的产生,也没有ADE。在进一步的体内杀伤试验中,发现接种了这三种肽段疫苗的小鼠体内均可杀伤用相应肽段共孵育过的靶细胞。同时接种包含CD4+和CD8+T细胞表位肽段疫苗的小鼠表现出最佳的体内杀伤率,达到40.6%的特异性杀伤率。而那些单独使用CD4+或CD8+T细胞表位疫苗免疫的小鼠则分别有24.5%或19.1%的特异性T细胞杀伤率。这些数据表明,由T细胞表位疫苗产生的保护作用,部分是由T细胞介导的细胞毒作用。并且这种保护作用不依赖中和抗体,所以没有诱导ADE的风险。因此,T细胞表位具有开发前景。我们也尝试T细胞疫苗与传统抗体疫苗的组合以提供更好的疫苗功效。尤其是在黄病毒疫苗领域,通过增强保护性的T细胞免疫可以抑制体内ADE的风险,是个值得探讨的问题。在这里,我们设计了ZIKV T细胞肽段疫苗和E80蛋白疫苗的组合免疫方案,我们发现联合免疫后的小鼠在感染后的第3天,所有疫苗接种组的病毒血症水平均显着降低至检测阈值（25 PFU/ml）。但是,在仅用E80免疫的小鼠中,血液中所检测到的病毒RNA（包括血液中细胞内的病毒RNA）却并未显着降低。相反,用CD4+或CD8+T细胞疫苗免疫的小鼠血液中的病毒RNA明显降低。在感染后第7天同样观察到了这种差异。这些数据提示CD4+或CD8+T细胞疫苗的加入能够提高E80蛋白疫苗的功效。综上,本次研究首先证实了ZIKV感染在小鼠中可以引起强烈而广泛的T细胞应答,并鉴定出一系列新颖的CD4+和CD8+T细胞表位,且发现其中一些表位可以激活细胞毒性T细胞作用。随后,使用这些新鉴定的带有免疫优势表位的肽段,我们开发出一种新型ZIKV T细胞备选疫苗,证明该疫苗可赋予接种疫苗的小鼠抗ZIKV感染的能力。我们也发现与单独接种任何一种疫苗相比,T细胞表位疫苗和E80重组蛋白疫苗的联合使用可以提供更好的保护。这些结果将为开发基于CD4+和CD8+T细胞表位的ZIKV T细胞疫苗提供理论基础和先导产品。并且该发现也有助于打破其他病毒的T细胞疫苗研发的固有思路,具有重要的借鉴意义。
胡青青[3]（2018）在《人/大鼠异源HER2特异性囊泡靶向的T细胞疫苗对HER2+乳腺癌免疫治疗的研究》文中提出目的:研究人/大鼠异源HER2特异性囊泡（exosome,EXO）靶向的T细胞（Hu Rt-TEXO）疫苗免疫治疗HER2+乳腺癌的作用。方法:1)通过常规DNA重组技术构建表达人HER21-407aa（Hu）和大鼠neu408-690aa（Rt）融合蛋白（Hu Rt）的pshuttle-CMV-Hu Rt重组转移质粒。将构建正确的pshuttle-CMV-Hu Rt重组转移质粒经Pme I酶切后与RGD修饰的p Ad Easy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中进行同源重组,得到的同源重组腺病毒质粒p Ad Easy-1-pshuttle-CMV-Hu Rt（简称为p Ad-Hu Rt）经Pac I酶切后再用脂质体Lipofectamine2000转染293人胚肾细胞包装出毒获得Ad VHu Rt重组腺病毒,并Ad VHu Rt经多轮感染293细胞中进行扩增、纯化。2)野生型小鼠BALB/c（H-2Kd）、双转基因小鼠HLA-A2/HER2（HLA-A2,HLA-A2限制性的人HER2特异性自身免疫耐受）的骨髓来源树突状细胞（BM-DC）培养,并Ad VHu Rt、Ad VHER2感染后收集DC上清超高速离心制备EXOHu Rt（H-2K d）、EXOHER2（H-2K d）;EXOHu Rt（HLA-A2）、EXOHER2（HLA-A2）。3)BALB/c、HLA-A2/HER2小鼠的脾细胞用刀豆蛋白Con A刺激活化后,再用小鼠CD4+T细胞分离试剂盒纯化活化的CD4+T细胞（CD4+TH-2K d、CD4+THLA-A2）。4)CD4+TH-2K d分别与EXOHu Rt（H-2K d）、EXOHER2（H-2K d）共孵育获得BALB/c（H-2Kd）来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO疫苗,用于BALB/c小鼠的疫苗接种;CD4+THLA-A2分别与EXOHu Rt（HLA-A2）、EXOHER2（HLA-A2）共孵育获得HLA-A2/HER2（HLA-A2）来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO疫苗,用于HLA-A2/HER2小鼠的疫苗接种。5)BALB/c（H-2Kd）来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO（用于对照）疫苗尾静脉注射免疫BALB/c小鼠6天后,FITC-CD4抗体、PE-CD44抗体染色后流式细胞术检测CD4+T细胞免疫反应;FITC-CD8抗体、PE-Tetramer染色后流式细胞术检测HER2特异性CD8+CTL反应。并且CFSE高浓度（HER2抗原肽负载,用作靶细胞）、CFSE低浓度（不相关抗原肽负载,阴性对照靶细胞）标记的BALB/c小鼠脾细胞尾静脉注射于Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO免疫6天的BALB/c小鼠,通过流式细胞术检测脾脏中CFSE高、低浓度靶细胞的残余,分析Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO刺激的CTL介导的H-2Kd限制性HER2特异性杀伤效应。初次免疫30天后,用Ad VHER2感染BALB/c来源的BM-DC（DCHER2）尾静脉注射加强免疫4天后,FITC-CD8抗体、PE-Tetramer染色后流式细胞术检测HER2特异性CD8+CTL的再次免疫应答能力。6)BALB/c（H-2Kd）来源的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO（用于对照）疫苗尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周一次,共两次。在第二次免疫三周后收获免疫小鼠的血清,然后通过用HER2-结合酶联免疫吸附实验（ELISA）测量血清中抗HER2抗体的浓度检测HER2特异性抗体免疫反应。7)人HER2表达的转基因小鼠乳腺癌细胞4T1HER2分别尾静脉、皮下注射建立早期的肺转移瘤、皮下移植瘤后,BALB/c（H-2Kd）来源制备的Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO（用于对照）疫苗尾静脉注射免疫,分析Hu Rt-TEXO、HER2-TEXO介导的治疗性抗肿瘤免疫。8)HLA-A2/HER2（HLA-A2）来源的Hu Rt-TEXO和HER2-TEXO（用于对照）疫苗尾静脉注射免疫双转基因HLA-A2/HER2小鼠。免疫6天后,皮下接种HLA-A2、HER2表达的转基因小鼠黑色素瘤细胞BL6-10A2/HER2进行肿瘤挑战,分析克服HER2特异性自身免疫耐受及预防性抗肿瘤免疫的能力。9)HLA-A2/HER2（HLA-A2）来源的Hu Rt-TEXO疫苗尾静脉注射免疫双转基因HLA-A2/HER2小鼠。免疫6天后纯化脾细胞中的CD8+T细胞,用照光过的Ad VHER2感染HLA-A2/HER2小鼠来源的BM-DC（DCHER2）体外再刺激,扩增后纯化制备HLA-A2限制性HER2特异性CD8+CTLs,并分析其对HLA-A2转基因的曲妥珠单抗耐药人HER2+乳腺癌细胞HLA-A2+HER2+BT474A2的杀伤活性。10)曲妥珠单抗耐药人HER2+乳腺癌细胞HLA-A2+HER2+BT474A2皮下接种无胸腺BALB/c裸鼠建立乳腺癌皮下移植瘤,然后用再刺激扩增的HLA-A2限制性HER2特异性CD8+CTLs尾静脉注射过继治疗,分析其对裸鼠体内曲妥珠单抗耐药HER2+乳腺癌HLA-A2+HER2+BT474A2移植瘤的治疗作用。结果:1)成功构建了表达人HER21-407aa（Hu）和大鼠neu408-690aa（Rt）融合蛋白（Hu Rt）的重组腺病毒Ad VHu Rt,并制备了人/大鼠异源HER2（Hu Rt）特异性囊泡靶向的T细胞（Hu Rt-TEXO）疫苗。2)在BALB/c野生型小鼠中,Hu Rt-TEXO疫苗较HER2-TEXO刺激了更强的CD4+T细胞反应,CD4+CD44+T细胞数量占外周血总CD4+T细胞的百分比分别为29.4%、23.1%（P<0.05）;Hu Rt-TEXO（血清抗HER2抗体量达70μg/ml）刺激HER2特异性体液免疫反应的能力也强于HER2-TEXO（40μg/ml）（P<0.05）。3)在BALB/c小鼠中,Hu Rt-TEXO疫苗较HER2-TEXO刺激了更强的HER2特异性CD8+CTL反应。Hu Rt-TEXO疫苗诱导的HER2特异性CD8+CTL占外周血总CD8+T细胞的百分比可达2.28%,体内杀伤了90%的HER2特异性靶细胞;而对照HER2-TEXO疫苗诱导的HER2特异性CD8+CTL只有1.31%,杀伤了53%的HER2特异性靶细胞（P<0.05）。并且Hu Rt-TEXO（3.51%）较HER2-TEXO（1.54%）刺激了更强的HER2特异性CTL免疫记忆（P<0.05）。4)Hu Rt-TEXO疫苗能够明显抑制在BALB/c小鼠中建立的早期4T1HER2小鼠乳腺癌肺转移瘤和皮下移植瘤的生长。与HER2-TEXO比较,Hu Rt-TEXO诱导了更强的治疗性抗肿瘤免疫（P<0.05）。5)在双转基因HLA-A2/HER2小鼠中,Hu Rt-TEXO疫苗完全（8/8）预防了表达HLA-A2、HER2的BL6-10A2/HER2黑色素瘤的生长,而HER2-TEXO疫苗只预防了3/8小鼠肿瘤的生长（P<0.05）。Hu Rt-TEXO更有效克服HER2的自身免疫耐受和增强HER2特异性的预防性抗肿瘤免疫。6)体外扩增的HLA-A2限制性、HER2特异性CTLs对曲妥珠单抗耐药的HLA-A2、HER2表达的BT474 A2人乳腺癌细胞在体外、裸鼠体内均具有明显的杀伤活性,几乎能根除已建立的3-4mm直径的BT474A2乳腺癌移植瘤的生长。结论:人/大鼠异源HER2特异性囊泡靶向的T细胞疫苗Hu Rt-TEXO能够增强HER2特异性体液、T细胞免疫反应,更有效打破HER2的自身免疫耐受,进而增强Hu Rt-TEXO疫苗诱导的保护性抗肿瘤免疫。Hu Rt-TEXO,一种潜在的HER2+乳腺癌治疗性疫苗,可能为曲妥株单抗耐药的HER2+乳腺癌病人提供一种新的治疗选择。
王一琳[4]（2017）在《HCV腺病毒载体疫苗AdNSmut的构建和免疫评价》文中进行了进一步梳理目的:丙型肝炎病毒（HCV）是全球性传染性疾病病原体,慢性感染可能引起肝炎、肝纤维化、肝硬化乃至肝癌。传统治疗方法利巴韦林与干扰素联用毒副作用较大,且持续病毒学应答率（Sustained virological response,SVR）较低,只有50%-60%。目前已经上市的直接抗病毒药物（Direct acting antiviral agents,DAAs）在某些地区持续病毒学应答率高达90%以上。然而DAAs治疗存在以下缺点:药物在疾病晚期不能逆转恶性化进展;DAAs药物价格昂贵,患者常无力负担;DAAs对于某些亚型HCV感染治疗效果较差;药物的使用不能防止新发感染;病毒易出现耐药性变异。接受DAAs治疗的患者,若是目前或曾经感染过HBV,再次感染还会导致严重肝损伤甚至死亡。因此,HCV疫苗的制备对于疾病的防治非常重要。当前研究中HCV疫苗种类有:重组蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗等。有多个疫苗进入了 Ⅰ/Ⅱ临床试验,DNA疫苗ChronVac-C、腺病毒载体疫苗Ad6-NS、ChAd3-NS等不仅可以在健康人体内诱发有效的体液免疫反应,还可以在慢性感染的患者体内提高干扰素加利巴韦林的持续病毒学应答率。HCV疫苗制备的主要障碍是基因序列的高度异质性,因此在一定的地域,应该根据该地区流行的HCV基因型序列片段。腺病毒载体疫苗以其安全有效、持续时间长、激发免疫反应强等特点成为疫苗研发较好的选择。特异性细胞免疫反应对于HCV的清除起到决定性的作用。因此,我们选取能激发显着细胞免疫的1b型HCVNS3-5Bmut片段,构建候选疫苗AdNSmut,并初步在小鼠上对NS3-5Bmut片段进行免疫原性评价,以期为后续HCV候选疫苗的临床前评价提供可供选择的免疫原和接种方案。方法:PCR从1b型HCV基因中扩增获得NS3-NS5B片段,定点突变NS5B基因使RNA聚合酶失去活性,获得NS3-NS5Bmut片段。将该目的片段连接入腺病毒穿梭质粒pDC315中,Western blot和免疫荧光鉴定该质粒外源基因NS3,NS5B蛋白的表达。重组穿梭质粒pDC315-NS3-5Bmut（缩写为pDC315-NSmut）与腺病毒骨架质粒共转染293A细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒AdNSmut,PCR检测外源基因完整性,RT-PCR检测mRNA转录情况,Western blot与质谱检测病毒感染细胞NS3-NS5B蛋白的表达。大量扩增并纯化AdNSmut腺病毒,测定病毒滴度。选择C57BL/6小鼠作为动物模型,分为接种缓冲液的安慰剂组、接种AdEGFP的阴性对照组、接种AdNSmut的实验组。不同病毒注射组分别肌肉注射 108PFU、109PFU、1010PFU、1011PFU 的 AdEGFP 或 AdNSmut,经过初次免疫3周,加强免疫2周后分离小鼠脾脏淋巴细胞,Elispot和流式胞内染色检测细胞免疫反应,眼球取血检测体液免疫反应。结果:PCR扩增获得HCV 1b NS3-5Bmut序列,成功构建pDC315-NSmut穿梭质粒,免疫荧光和Western blot证实该质粒能表达正确的NS3 NS5B外源蛋白。重组穿梭质粒和骨架质粒共转染293A细胞,包装产生了具有感染性且表达外源基因的复制缺陷型重组腺病毒AdNSmut。纯化后获得滴度为2.74×1013PFU/ml的高纯度高滴度病毒,用于免疫接种C57BL/6小鼠,免疫后检测到接种AdNSmut的小鼠有显着的HCV特异性细胞免疫反应。结论:本研究成功构建了能够表达1b型HCV非结构蛋白NS3-5Bmut的复制缺陷型重组腺病毒AdNSmut。该重组腺病毒能够实现快速、大量、高纯度制备,能够在C57BL/6小鼠体内诱发显着地细胞免疫反应,安全有效,证明NS3-5Bmut片段有望作为HCV候选疫苗的免疫原,同时也为HCV腺病毒疫苗动物实验病毒接种滴度和免疫方案提供了参考。
管洁,邓瑶,陈红,杨扬,文波,谭文杰[5]（2015）在《表达丙型肝炎病毒（HCV）截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析》文中认为为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3（Nonstructural protein 3,NS3）与核心蛋白（core）融合抗原的重组腺病毒疫苗。体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答。该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+CD4+T细胞亚群。采用异型（JFH1,2a型）HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护。本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考。
李婷婷,殷森,黎诚耀[6]（2015）在《丙型肝炎疫苗最新研究进展——挑战与希望并存》文中研究说明丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染而引起的病毒性肝炎,目前感染率高、慢性化程度严重、临床治疗效果不理想、治疗花费巨大,迫切需要研发有效的疫苗进行防治。本文将影响疫苗研发的关键问题,抗病毒分子免疫应答在控制HCV感染过程中的作用和HCV感染模型,与丙肝疫苗研究相融合,对当前丙肝疫苗的最新研究策略和进展作一综述。
刘文宇,戚中田[7]（2010）在《丙型肝炎疫苗的研究进展与挑战》文中认为丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是具有高度基因变异性的RNA病毒,恢复期患者或黑猩猩再次暴露于不同型（株）病毒时可发生再感染。因此,研发HCV疫苗存在着巨大的挑战。HCV预防性疫苗黑猩猩体内研究证实,诱导并保持针对多个病毒表位的辅助T细胞和细胞毒性T细胞（cytotoxic T-lymphocyte,CTL）的免疫应答,是清除病毒和防止慢性感染的必要环节。多特异性B细胞应答可快速诱导产生交叉中和抗体,这些抗体有助于细胞免疫应答。此文总结候选HCV疫苗在分子病毒学和抗病毒免疫应答中的研究进展,并就疫苗在黑猩猩和HCV感染者的体内试验研究进行综述。
马晓红[8]（2009）在《卵清蛋白免疫耐受因子免疫学活性的研究》文中研究说明免疫耐受作为机体免疫调节的重要组成部分之一,在免疫系统识别“己”和“非己”的过程中发挥着关键作用。其中,外周免疫耐受的形成和维持与临床上自身免疫性疫病、过敏反应以及抗移植物排斥等人类重大疾病的治疗密切相关。因此,阐明外周耐受产生和维持的分子机制不仅有利于进一步完善免疫学理论,对于临床上免疫耐受相关疾病的治疗也具有十分重要的指导意义。根据外周耐受能够通过人工转移其效应细胞（或分子）在个体间进行传递的特点,人们发现,CD4+CD25+等调节性T细胞是外周耐受产生的主要介导者。此外,还有一些报道指出,某些大分子物质也能够转移特异性外周耐受给个正常个体。然而,小分子的非细胞成分是否也能够携带并传递特异性免疫耐受信息,至今未见相关报道。本研究就这一问题进行了初步探讨。本研究首先通过多次尾静脉注射卵清蛋白（ovalbumin, OVA）建立了对OVA免疫耐受的BALB/c小鼠模型,并对其耐受效果进行了鉴定。在此基础上制备了3个不同分子量范围的耐受小鼠脾淋巴细胞裂解液,通过对其转移耐受的效果进行评估,确定了转移OVA耐受的主要效应分子所在的分子量范围,并将这一分子量范围的细胞裂解液称为（OVA immune tolerance factors,OVA ITFs）。为进一步探讨OVA ITFs转移耐受的免疫学活性,本研究以OVA耐受鼠脾淋巴细胞为阳性对照,研究了OVA ITFs对正常BALB/c受体小鼠外周CD4+CD25+ T细胞亚群比例、DTH反应、OVA特异性T淋巴细胞增殖以及抑制性细胞因子IL-10、TGF-β1分泌水平的影响。现将研究结果报道如下:1. BALB/c小鼠多次尾静脉注射OVA（5μg/只）后,特异性T淋巴细胞增殖刺激指数（Stimulation Index ,SI）增殖的SI值为0.721±0.03,显着低于对照组（1.676±0.07）;CD4+CD25+ T细胞亚群在总CD4+T细胞的比例为15.37±0.22%,较对照组小鼠显着升高（11.23±0.41%）。结果表明,多次注射小剂量OVA可建立BALB/c小鼠对OVA的免疫耐受。2.分别制备分子量小于3ku、35ku和大于5ku三个分子量范围的耐受小鼠脾淋巴细胞裂解液。体外试验显示,向淋巴细胞培养系统中加入2倍稀释的各分子量范围细胞裂解液,对OVA特异性T细胞增殖的抑制率分别为40.4%、18.4%和7.9%;体内试验显示,转移各分子量范围的细胞裂解液给正常小鼠后,受体鼠OVA特异性T细胞增殖的SI值分别为0.557±0.02、0.954±0.07和1.094±0.01,与空白组（1.110±0.09）相比,只有分子量小于3ku的裂解液产生的具有显着的抑制效果。此外,各分子量范围的细胞裂解液还产生了一定的非特异性抑制作用。结果表明,分子量小于3ku的耐受小鼠脾淋巴细胞裂解液能够显着抑制OVA特异性T细胞的增殖。3.转移OVA ITFs或OVA耐受鼠脾淋巴细胞后,受体鼠脾脏CD4+CD25+ T细胞亚群在总CD4+ T细胞的比例逐渐上升,分别于转移后7天和3天达到峰值,为15.32±1.03%和15.35±0.62%;外周血中CD4+CD25+ T细胞亚群的比例也分别于转移后7天和3天达到峰值,为10.10±0.21%和10.07±0.07%,均较转移前（9.97±1.38% and 7.28±0.12%）显着上升。结果表明,OVA ITFs能够诱导外周CD4+CD25+ T细胞的产生,但与耐受鼠淋巴细胞相比,其诱导外周CD4+CD25+ T细胞亚群达到峰值需要更长的时间。4.转移OVA ITFs或OVA耐受鼠脾淋巴细胞后免疫OVA并激发DTH,检测其对OVA特异性免疫反应的抑制效果。结果表明,OVA ITFs能够有效抑制受体小鼠的DTH反应,其反应部位的皮肤增厚下降了60%。5.转移OVA ITFs或OVA耐受鼠脾淋巴细胞后免疫OVA,受体鼠特异性淋巴细胞增殖的SI值分别为0.699±0.05和0.704±0.03,与对照组（1.356±0.07）相比明显受到抑制;培养上清中TGF-β1的分泌量分别为129.15±6.14和106.71±2.89 pg/mL,显着高于对照组（52.82±3.68 pg/mL）, IL-10的分泌量未检出。结果表明,OVA ITFs能有效抑制OVA特异性T细胞的增殖并促进抑制性细胞因子TGF-β1的的产生。6.转移空白小鼠的脾淋巴细胞裂解液（OVA ITFs control）后,受体小鼠的外周CD4+CD25+ T细胞比例、OVA特异性淋巴细胞增殖及TGF-β1、IL-10分泌量均无显着变化。说明OVA ITFs并非机体的固有成分,而是由免疫耐受个体获得性产生的。以上研究结果表明,本研究所制备的OVA ITFs具有将OVA特异性免疫耐受传递给正常受体小鼠的特性。这一结果首次证明了小分子物质也能够携带并传递特异性免疫耐受信息,这对进一步阐明外周耐受的分子机制以及指导临床上自身免疫病、抗移植物排斥等免疫耐受相关疾病的治疗具有重要的参考价值。
任艳丽[9]（2009）在《HCV E2蛋白促进B淋巴细胞活化和增殖的机制及E2蛋白突变体免疫原性分析》文中提出丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是带有包膜的正链RNA病毒,主要经血液传播,引起急、慢性丙型肝炎,并可导致肝硬化和肝细胞癌。HCV感染除引起肝脏病变外,还可引起多种肝脏外组织损害,与B细胞淋巴瘤、冷球蛋白血症等多种肝外疾病有关。目前全球HCV感染者约有1.7亿,HCV感染的慢性率高达80%。HCV的基因变异,对宿主细胞内免疫的拮抗作用以及相对低水平表达和复制等均与HCV慢性感染有关。最近的一些研究发现,HCV包膜E2蛋白与CD81分子结合所致免疫细胞的功能紊乱也可能是HCV慢性感染的重要原因,并且与B细胞淋巴瘤以及冷球蛋白血症具有重要相关性。HCV包膜E2蛋白的CD81结合活性还可能与HCV感染难以诱导中和抗体而导致慢性感染有关。一、HCV包膜蛋白E2促进B淋巴细胞活化和增殖的作用机制HCV包膜E2蛋白通过与B淋巴细胞表面上CD81分子的作用,改变了B细胞激活的正常信号转导通路,导致B淋巴细胞非特异性活化。我们构建了HCV包膜E2蛋白的表达质粒,转染细胞表达HCVE2蛋白。将表达的E2蛋白固定在事先包被了E2单抗的酶标微孔板上,然后加入Burkitt淋巴瘤Raji细胞,可观察到该细胞聚集贴附生长。然而用siRNA下调Raji细胞表面CD81的表达,则不能使Raji细胞聚集贴附生长,说明表达的E2蛋白能够与Raji细胞表面的CD81分子结合。进一步我们制备固定化的E2蛋白,并分别用固定化的E2和可溶性E2蛋白刺激Raji细胞,然后分析细胞内蛋白酪氨酸磷酸化的水平。结果表明,固相化的E2蛋白可有效上调Raji细胞内的蛋白酪氨酸磷酸化的水平,而可溶性E2对Raji细胞内的蛋白酪氨酸磷酸化水平则无明显影响。这可能是因为固相化的E2蛋白类似天然的病毒颗粒,在构象上要更接近于天然的病毒颗粒表面E2蛋白,而且固相化后的E2蛋白在单位体积的密度要高于可溶性的E2蛋白单位体积的密度,使其能够更充分的与细胞表面的CD81分子相互接触作用。构建CD81分子siRNA的慢病毒载体,转染293T细胞包装出病毒后感染Raji细胞,流式检测Raji细胞表面CD81分子表达被抑制,进一步用固相化的E2蛋白刺激该CD81表达下调的Raji细胞,则观察到Raji细胞内的蛋白酪氨酸磷酸化水平无明显的变化,这说明E2蛋白对Raji细胞的信号调节是经由CD81分子作用的。固相化的E2蛋白刺激Raji细胞后用western blotting技术检测细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表达,可以观察到Bcl-2蛋白表达下降,而Bax蛋白表达增加。Bcl-2基因是人体最主要的抗凋亡基因,它编码的蛋白质产物定位于线粒体内膜、内质网膜及核膜上,其主要生物学功能是延长细胞的寿命,增加细胞对各种凋亡刺激因素的抵抗力.它可导致DNA受损的细胞持续生存,突变产物聚集,从而促进肿瘤的发生与发展。Bcl-2相关X蛋白（Bax）具有加速细胞凋亡的功能, Bax可与抗凋亡基因Bcl-2形成异源二聚体,具有抑制Bcl-2,促进细胞凋亡的作用。Bcl-2与Bax两者之间的比例决定了细胞的命运,若Bax占多数,则Bcl-2被抑制,凋亡被诱导,细胞死亡;反之则Bax受到抑制,细胞得以生存。E2蛋白刺激Raji细胞后促进Bcl-2的表达而抑制Bax的表达,这说明E2蛋白能够增强Raji细胞的抗凋亡能力。E2蛋白能够诱导B细胞蛋白酪氨发生酸磷酸化且促进B细胞的抗凋亡的能力,这些可能是E2促进B细胞增殖的重要机制。用流式细胞技术检测固相化HCV E2蛋白刺激的Raji细胞表面CD80、CD86和CD21分子的表达,结果可看到CD80和CD86分子的表达上调,而CD21分子的表达下降,CD80、CD86和CD21是与B淋巴细胞的活化紧密相关的膜表面分子,这说明E2蛋白能刺激Raji细胞的活化,从而也促进Raji细胞的增殖。二、HCV E2蛋白突变体免疫原性分析研究表明HCV包膜E2蛋白可诱导B淋巴细胞蛋白酪氨酸磷酸化,通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白Bax的表达而促进B淋巴瘤细胞的增殖,并且还能上调活化分子的表达,说明E2蛋白能通过激活胞内信号转导通路发挥一系列生物学效应。而E2对B细胞的激活可能导致HCV感染难以有效诱导中和抗体,因此,消除E2蛋白的CD81结合活性可能有利于中和抗体的诱导。我们分别将H77株的E2蛋白的第442位苯丙氨酸（F）和529位的色氨酸（W）突变为丙氨酸（A）,构建质粒转染细胞,用E2多抗对细胞培养上清以及细胞裂解液中的E2蛋白表达进行检测,结果表明突变对E2的表达和分泌无明显影响。用ELISA分析两种突变的E2蛋白与大肠杆菌表达的Trx（硫氧还蛋白）-CD81 LEL（大胞外环）融合蛋白的结合情况,结果显示,该两个位点的突变体不再具有与CD81大胞外环（LEL）的结合活性;进一步用流式细胞术（FACS）分析两种E2突变体与表达CD81分子的CHO细胞结合情况表明,该两个位点突变的E2蛋白不再具有与膜表面的CD81分子结合的功能。用突变体质粒E2-W529/A和E2-W442/A转染细胞后,免疫荧光检测两株构象依赖性单抗与突变体E2蛋白的反应,结果表明,该两个位点的突变对E2蛋白空间构象无明显影响。将固相化的两种突变体E2蛋白分别刺激Raji细胞,没有检测到细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平发生明显变化,这表明,消除CD81结合活性可消除E2蛋白对Raji细胞胞内信号转导的激活作用。HCV E2蛋白第442和529位氨基酸分别位于两个线性B细胞表位中,其中,前者所在表位抗体具有中和活性,而后者病毒中和活性并不明显。因此,选择529位的突变体进行免疫可有利于保留更多的中和抗体表位。我们将野生E2与突变体E2-W529/A表达质粒分别免疫小鼠,眼眶取血收集免疫小鼠的血清,分别用野生和突变的E2蛋白为靶抗原检测小鼠的抗体动力学,结果表明,两种DNA免疫小鼠血清的E2抗体动力学水平相似,这说明W529/A突变对于E2蛋白的免疫原性无明显影响。524～531位氨基酸残基APTYSWGA为一线性B细胞表位,其抗体能抑制E2蛋白与CD81的结合。我们将该表位与红色荧光蛋白融合,构建表达质粒转染细胞,用免疫荧光分析该表位与小鼠血清的结合,结果表明,W529A的突变部分降低了该表位的免疫原性/抗原性。AP33表位为HCV E2蛋白第412～423位氨基酸残基QLINTNGSWHIN,也为一线性B细胞表位,其在HCV的六个基因型中高度保守,AP33能有效中和HCV的感染性。同样构建该表位与红色荧光蛋白RFP融合表达的质粒,转染细胞用免疫荧光分析其与小鼠血清的结合表明,W529/A突变不影响该表位的抗体应答,野生或突变E2均可诱导针对该表位的抗体。构建11株HCV（涵盖6个基因型）包膜E2蛋白的表达质粒,转染细胞用免疫荧光分析小鼠免疫血清与这些不同株不同基因型E2蛋白的反应,结果表明,E2-W529/A免疫血清可与该11株HCV包膜蛋白发生交叉反应。为了评价免疫血清的中和作用,我们构建了五株HCV包膜蛋白的HCVpp进行中和试验。从结果可见,野生型E2以及E2-W529/A突变体免疫血清均可有效中和这八株HCVpp对靶细胞Huh7.5的感染性,且对同株HCVpp的中和效率无明显差异。进一步我们用JHF-1株HCVcc评价小鼠血清的中和作用,结果表明两种质粒免疫血清均可抑制HCVcc的感染性,抑制效率相似。三、小结1.本研究中用固相化的HCV包膜蛋白E2刺激人B淋巴细胞Raji细胞,可诱导Raji细胞内的蛋白酪氨酸的磷酸化,而用siRNA干扰掉B细胞表面CD81的表达后用E2蛋白再刺激Raji细胞,细胞内酪氨酸磷酸化的水平未发生明显的变化。而且E2蛋白刺激Raji细胞可上调Raji细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,并促进膜表面CD80、CD86分子的表达,下调膜表面CD21分子的表达。这些结果表明HCV包膜蛋白E2可通过与CD81分子作用改变B淋巴细胞内信号的转导,从而引起的B细胞的增殖和非特异性激活。2.在此基础上,我们构建了一种E2蛋白突变体,将第529位色氨酸突变为丙氨酸,该W529/A突变体不影响E2蛋白的空间构象,但是消除了与CD81的结合活性。该突变体刺激B淋巴细胞后,对B细胞的胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平变化影响不明显。以DNA免疫的方式进行小鼠免疫,一次免疫可使小鼠抗体阳转率达到100%,抗体应答（包括E2总抗体以及针对中和抗体表位的抗体）与天然E2免疫无明显差异,并且能有效诱导HCV交叉中和抗体。由于该突变体对B细胞无另外刺激,不导致B细胞的非特异激活,但可有效诱导中和抗体,因此可望作为HCV疫苗的有效研究方向,可代表一种HCV疫苗的发展策略。
钱芳[10]（2008）在《T细胞疫苗对BXSB鼠外周血CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞及Foxp3基因的影响》文中进行了进一步梳理系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种累及多器官、多系统的自身免疫性疾病,其患病率高达70-100/10万。如果以全国16亿人口计算,我国的SLE患者已达112-160万之多,且多为年轻女性。其发病机制复杂,临床变化多端,诊治困难,死亡率高。目前治疗SLE的方法很多,首选的治疗方法是糖皮质激素制剂。开始时剂量需较大,以期在1-2周内控制病情,必要时可应用皮质类固醇激素冲击疗法或加用免疫抑制剂治疗。但在皮质类固醇激素和（或）免疫抑制剂治疗过程中,由于用药量大,时间长,容易出现副作用和并发症,如感染（病毒、细菌、真菌等）、诱发糖尿病、消化道溃疡、穿孔或消化道出血、骨折及骨缺血性坏死、精神异常等,很多患者最后死于激素的副作用和/或并发症,严重影响患者的生存期和生活质量。同时,由于上述药物的选择性不理想,部分患者经正规治疗仍不能有效控制病情。大剂量免疫球蛋白冲击疗法、血浆置换疗法以及周身淋巴结照射治疗等,由于未能针对病因治疗,且疗效短暂、费用较高,不能广泛应用。造血干细胞移植治疗虽有令人鼓舞的报告,然而技术条件要求高,价格也甚昂贵,很难普遍推广。因此,SLE的治疗仍是目前国内外公认的医学难题,尚无有效根治方法。1981年BEU-NUN等人在研究由髓磷脂碱性蛋白（MBP）主动免疫诱导的Lewis大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）时,第一次提出了T细胞疫苗（T cell Vaccine,TCV）的概念。目前国内外学者对一些与T细胞介导有关的自身免疫性疾病（Autoimmune deseases,AID）,器官、组织移植术后进行了T细胞疫苗治疗的实验研究,如类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）、自身免疫性甲状腺炎、免疫性心肌炎等,都取得令人鼓舞的结果。并且临床上将之应用于治疗RA,也取得了初步疗效。SLE是以T和B淋巴细胞功能异常为特点的自身免疫性疾病,自身反应性T淋巴细胞的活化及由此介导的自身免疫反应是本病发生的中心环节。早在上世纪90年代国外已有学者研究显示,抑制自身反应性T细胞的活性,可降低SLE病情的严重性及延长狼疮鼠的寿命。因此清除自身反应性T细胞可能是SLE又一新的治疗途径。识别自身抗原的自身反应性T细胞,是正常T细胞库的一部分,存在于外周循环中。独特型—抗独特型网络理论认为,在正常机体中,自身反应性T细胞受抗独特型的调节性T细胞的制约,处在数量较少和活性较低的状态,不引起AID,一旦这一免疫自稳状态被破坏,自身反应性T细胞便可活化、增殖并引起病理损害。针对这一理论,用灭活的自身反应性T细胞,诱导机体产生大量的调节性T细胞来抵抗自身反应性T细胞的致病作用,即为TCV的治疗原理,这项治疗措施是目前研究AID治疗的新方向。CD4+CD25+T细胞是一种重要的调节性T细胞,最近越来越多的研究显示,CD4+CD25+T细胞数量及功能异常与许多AID有密切关系,免疫学上目前将CD4+CD25+T细胞视为调节性T细胞的代名词。CD4+CD25+调节性T细胞在SLE中的作用也是目前SLE发病机制的研究热点,多项研究发现,CD4+CD25+调节性T细胞在SLE患者中存在数量减少,或功能异常,与SLE患者病情密切相关。故本实验制备T细胞疫苗,免疫BXSB鼠后,检测CD4+CD25+ T细胞,研究TCV对该细胞水平的影响,从而评价T细胞疫苗在SLE治疗上的应用前景。另外,转录因子Foxp3与CD4+CD25+ T细胞的关系也是近年研究的热点,国内外多项研究已经证实,Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞的功能相关基因,它作为CD4+CD25+调节性T细胞一个相对特异的标志,它的表达是该细胞发育及发挥功能的前提。有学者研究显示,SLE患者外周血Foxp3的表达下降,同时其表达水平与CD4+CD25+调节性T细胞数量呈依赖关系。所以Foxp3基因的检测及相关分析,也是SLE治疗免疫学上的一个新指标,并有可能揭示TCV的治疗机制。T细胞是在双信号刺激下发生活化和增殖反应的。TCR/CD3复合物与抗体递呈细胞上的MHC结合形成第一信号,进而CD28与相应配体CD80或CD86结合产生共刺激信号,致T淋巴细胞活化从而引发细胞免疫。Salomon B通过给狼疮鼠注射CD28的拮抗剂,发现ds-DNA抗体的产生与CD28-CD86共刺激分子的作用有关,且注射CD28拮抗剂能降低狼疮肾炎的发病率,延长小鼠的寿命。由此可见CD28-CD86共刺激通路在SLE的发病中具有重要的作用。国内有学者研究提示,CD8+CD28+T细胞在SLE患者外周血中表达下降,提示该细胞也可能是反映和监测SLE病情的一个指标。但有关CD8+CD28+T细胞在SLE疾病发生发展中的作用的研究报道甚少。因此本文另一目的是通过检测经TCV免疫的BXSB鼠前后CD8+CD28+T细胞的变化,来分析该细胞亚群在SLE发病中的变化及与SLE病情的关系,以从另一方面揭示TCV的治疗作用。T细胞疫苗在系统性红斑狼疮中的实验研究国内做的不多,本文旨在结合上述SLE发病机制中免疫学方面新的进展,研究T细胞疫苗免疫BXSB鼠后,CD4+CD25+T细胞及相关基因Foxp3,和CD8+CD28+T细胞的变化,来探讨TCV治疗的可能机制和应用前景。目的1.研究T细胞疫苗免疫对BXSB鼠外周血CD4+CD25+调节性T细胞、CD8+CD28+T细胞表达水平的影响,探讨T细胞疫苗治疗SLE的可能机制。2.研究BXSB鼠经T细胞疫苗免疫后基因Foxp3表达的变化,及其与CD4+CD25+调节性T细胞的关系,从基因水平分析T细胞疫苗的可能机制。材料与方法1实验动物2.5月龄BXSB雄性小鼠12只,体重22-27g,北京大学医学院免疫系提供,饲养在南方医院SPF实验室。2方法（1）狼疮鼠T细胞的分离运用目前T细胞疫苗实验研究中常用的提取方法,即从BXSB鼠脾脏提取细胞。一切操作均严格遵守无菌操作及试剂说明书规则进行。（2） T细胞疫苗的制备将提取的脾脏细胞悬液经伴刀豆球蛋白Con A（2.5ug/ml）有丝分裂、增殖,后用丝裂霉素C（25ug/ml）处理细胞,调整细胞浓度备用。（3） T细胞疫苗皮下免疫取1×107细胞皮下免疫,并于首次免疫后第1,2周分别重复免疫。（4）检测:于免疫前,首次免疫后1周、2周和4周分别从尾静脉取血1ml,采用流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞的细胞比例及基因Foxp3表达比率。（5）统计学处理组间CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞水平及Foxp3比率的比较应用SPSS11.5统计软件处理数据,进行重复测量数据的方差分析,结果中数据以“（?）±s”表示。CD4+CD25+T细胞与基因Foxp3表达水平进行双变量相关分析。结果1 TCV对BXSB鼠外周血CD4+CD25+T细胞的影响1.1 TCV免疫BXSB鼠前后不同时间段内CD4+CD25+T细胞的表达Mauchly球形检验统计量W=0.429,P=0.261本研究显示,不拒绝球形假设,应用单变量检验方法时无需ε（epsilon）校正。TCV免疫前后不同时间段内CD4+CD25+T细胞表达水平差异有显着性意义（F=16.441,P=0.000）。1.2 TCV免疫BXSB鼠后CD4+CD25+T细胞水平与免疫前比较CD4+CD25+T细胞在经TCV免疫后不同时间段均有不同程度的表达,且免疫后该细胞表达水平均值均高于免疫前。其中,免疫后1周与免疫前相比差异无统计学意义（P=0.075）;免疫后2周、4周与免疫前相比差异有统计学意义（P值均为0.000）。1.3 TCV免疫BXSB鼠后各时间段之间的CD4+CD25+T细胞水平的比较TCV免疫后2周、4周CD4+CD25+T细胞水平与免疫后1周相比差异均有统计学意义（P值分别为0.002,0.003）;免疫后4周与免疫后2周相比差异无统计学意义（P=0.559）。2 TCV对BXSB鼠基因Foxp3的影响2.1 TCV免疫BXSB鼠前后不同时间段内基因Foxp3的表达水平Mauchly球形检验统计量W=0.409,P=0.231本研究显示,不拒绝球形假设,应用单变量检验方法时无需ε（epsilon）校正。TCV免疫前后不同时间段内基因Foxp3的表达水平差异有显着性意义（F=15.388,P=0.000）。2.2 TCV免疫BXSB鼠后Foxp3基因的表达水平与免疫前比较基因Foxp3在经TCV免疫后不同时间段的表达均值均高于免疫前。其中,免疫后1周和免疫前比较,二者无统计学意义（P=0.251）;免疫后2周、4周与免疫前相比差异均有统计学意义（P值分别为0.003,0.002）。2.3 TCV免疫BXSB鼠后各时间段之间基因Foxp3表达水平的比较免疫后2周、4周基因Foxp3的表达水平与免疫后1周相比差异均有统计学意义（P值分别为0.004,0.002）;免疫后4周与免疫后2周相比差异无统计学意义（P=0.143）。3基因Foxp3的表达与CD4+CD25+T细胞水平的相关分析经相关分析,Spearmon相关系数rs=0.631,P=0.000（双侧）,即认为基因Foxp3的表达与CD4+CD25+T细胞的水平存在正相关关系。4 TCV对BXSB鼠外周血CD8+CD28+T细胞的影响4.1 TCV免疫BXSB鼠前后不同时间段内CD8+CD28+T细胞表达Mauchly球形检验统计量W=0.498,P=0.375本研究显示,不拒绝球形假设,应用单变量检验方法时无需ε（epsilon）校正。T细胞免疫前后不同时间段内CD8+CD28+T细胞表达水平差异有显着性意义（F=16.172,P=0.000）。4.2 TCV免疫BXSB鼠后CD8+CD28+T细胞水平与免疫前比较CD8+CD28+T细胞在T细胞疫苗免疫后不同时间段均有不同程度的表达,且免疫后该细胞表达水平均值均高于免疫前。且免疫后1周、2周及4周与免疫前相比差异均有统计学意义（P值分别为0.010,0.001,0.001）。4.3 TCV免疫BXSB鼠后各时间段之间的CD8+CD28+T细胞水平的比较免疫后2周、4周CD8+CD28+T细胞水平与免疫后1周相比差异均有统计学意义（P值分别为0.025,0.007）;免疫后4周与免疫后2周相比差异无统计学意义（P=0.074）。结论1.BXSB鼠经T细胞免疫后,可促进CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞水平的升高,提示T细胞疫苗可影响BXSB鼠体内的免疫状态。这可能是T细胞疫苗发挥治疗作用的主要机制。2.CD4+CD25+T细胞的水平与基因Foxp3的表达呈正相关,提示T细胞疫苗可能从基因水平发挥治疗作用。
二、T细胞疫苗对HCV的清除作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、T细胞疫苗对HCV的清除作用（论文提纲范文）
（2）基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 寨卡病毒的流行概况 |
| 1.1.1 寨卡病毒的发现及传播 |
| 1.1.2 寨卡病毒的全球流行 |
| 1.2 寨卡病毒的临床特征和发病机制 |
| 1.2.1 寨卡病毒的临床特征 |
| 1.2.2 寨卡病毒的细胞感染机制 |
| 1.3 疫苗的保护机制 |
| 1.4 寨卡病毒疫苗的研究现状 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 减毒疫苗 |
| 1.4.3 核酸疫苗 |
| 1.4.4 重组疫苗 |
| 1.5 T细胞反应在寨卡病毒感染过程中的作用 |
| 1.5.1 T细胞在寨卡病毒感染小鼠过程中的作用 |
| 1.5.2 T 细胞在寨卡病毒感染人过程中的作用 |
| 1.6 研究设计与拟解决的问题 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 肽段的设计与合成 |
| 2.2 细胞的培养、传代以及冻存 |
| 2.3 病毒培养及滴度测定 |
| 2.3.1 病毒培养 |
| 2.3.2 病毒滴度测定 |
| 2.4 Balb/c小鼠病毒感染模型的建立 |
| 2.5 细胞因子检测 |
| 2.5.1 通过ELISPOT对 IFN-γ分泌量的检测 |
| 2.5.2 通过FACS对 IFN-γ、IL-2 分泌量的检测 |
| 2.6 寨卡病毒中和试验 |
| 2.7 体外检测抗体依赖的增强感染作用 |
| 2.8 T细胞体内杀伤实验小鼠模型的建立 |
| 2.8.1 T细胞体内杀伤实验 |
| 2.8.2 样品的处理及数据的检测、分析 |
| 2.9 病毒拷贝的核酸检测法 |
| 2.9.1 检测样本RNA的抽提 |
| 2.9.2 通过qRT-PCR法检测病毒拷贝 |
| 2.10 数据的处理及分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 寨卡病毒全蛋白组的T细胞表位筛选 |
| 3.1.1 寨卡病毒感染的Balb/c小鼠能被刺激起强而广的T细胞反应 |
| 3.1.2 寨卡病毒T细胞表位的MHC限制性 |
| 3.2 寨卡病毒特异性的 T 细胞反应介导体内细胞毒作用 |
| 3.3 CpG 佐剂比铝佐剂能更好的激活 CD8+ T 细胞反应 |
| 3.4 肽段免疫的小鼠能对寨卡病毒的感染提供保护作用 |
| 3.4.1 肽段免疫策略以及免疫原性检测 |
| 3.4.2 肽段免疫诱导的保护性检测 |
| 3.4.3 肽段免疫通过T细胞杀伤提供保护作用 |
| 3.5 寨卡病毒亚单位疫苗与T细胞疫苗联合使用的协同作用分析 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 课题结论及其意义 |
| 4.2 可以通过IFN-γELISPOT高效筛选T细胞表位 |
| 4.3 肽段免疫中CD8+T 细胞表位肽段的弱免疫原性 |
| 4.4 T细胞反应在避免ADE过程中发挥作用 |
| 4.5 进一步提高多表位疫苗免疫原性的可能方法 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）人/大鼠异源HER2特异性囊泡靶向的T细胞疫苗对HER2+乳腺癌免疫治疗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1.肿瘤抗原HER2是HER2~+乳腺癌免疫治疗的重要靶标 |
| 2.囊泡介导的细胞间信息交流具有重要的生理、病理意义 |
| 3.树突状细胞(DC)来源的囊泡(Dexo)是一种具免疫刺激作用的无细胞瘤苗 |
| 4.Dexo囊泡靶向的CD4~+T细胞(T_(EXO))疫苗是一种能够有效打破肿瘤自身免疫耐受的新型瘤苗 |
| 5.异源抗原疫苗能有效克服自身免疫耐受,人HER2和大鼠neu融合蛋白(HuRt)异源抗原特异性HuRt-T_(EXO)疫苗有望增强HER2~+乳腺癌的免疫疗效 |
| 方法 |
| 1.AdVHuRt重组腺病毒的制备 |
| 2.HLA-A2-HER2双转基因小鼠模型的建立 |
| 3.HuRt特异性EXO靶向的HuRt-TEXO疫苗制备 |
| 4.HuRt-TEXO疫苗诱导的T细胞免疫反应检测 |
| 5.HuRt-TEXO疫苗刺激的HER2特异性抗体(体液免疫)检测 |
| 6.肿瘤靶细胞的构建 |
| 7.细胞毒活性实验 |
| 8.肿瘤动物实验 |
| 9.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.构建了表达融合蛋白HuRt的重组腺病毒 |
| 2.HuRt-T_(EXO)疫苗在野生型BALB/c小鼠中刺激了更强的HER2特异性体液免疫反应 |
| 3.HuRt-T_(EXO)疫苗在野生型BALB/c小鼠中刺激了更强的HER2特异性CTL免疫反应和记忆 |
| 4.HuRt-T_(EXO)疫苗在野生型BALB/c小鼠中刺激了更强的治疗性抗肿瘤免疫 |
| 5.HuRt-T_(EXO)疫苗在HLA-A2/HER2转基因小鼠中克服了HER2特异性自身免疫耐受 |
| 6.HuRt-T_(EXO)疫苗刺激的HER2特异性CTLs在体外、裸鼠体内对人HER2+乳腺癌细胞均具有明显的杀伤活性 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（4）HCV腺病毒载体疫苗AdNSmut的构建和免疫评价（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 1 |
| 前言 1.1 |
| 丙型肝炎病毒学特性 1.2 |
| HCV型别和分布 1.3 |
| HCV免疫应答 1.4 |
| HCV治疗现状 1.5 |
| HCV疫苗研究现状 1.6 |
| 腺病毒生物特性 1.7 |
| 本研究的目的和意义 2 |
| 材料 2.1 |
| 实验动物 2.2 |
| 试剂 2.3 |
| 菌株、质粒和细胞株 2.4 |
| 主要仪器与耗材 2.5 |
| 主要溶液配置 3 |
| 方法 3.1 |
| 携带HCV |
| NS3-5Bmut基因重组穿梭载体的构建 3.2 |
| 重组穿梭质粒的瞬时转染与蛋白表达鉴定 3.3 |
| 复制缺陷型重组腺病毒构建和空斑纯化 3.4 |
| 复制缺陷型重组腺病毒AdNSmut稳定株的扩增和纯化 3.5 |
| 重组腺病毒的鉴定 3.6 |
| 小鼠腺病毒接种以及免疫反应检测 4 |
| 结果 4.1 |
| 质粒pDC315-NSmut的成功构建 4.2 |
| 重组穿梭质粒pDC315-NSmut的瞬时转染表达鉴定 4.3 |
| 重组腺病毒AdNSmut基因组外源基因NS3-5Bmut完整性鉴定 4.4 |
| 重组腺病毒AdNSmut感染细胞后目的蛋白表达鉴定结果 4.5 |
| CsC1纯化后重组腺病毒AdNSmut滴度测定 4.6 |
| 重组腺病毒AdNSmut小鼠动物实验测定细胞免疫反应结果 5 |
| 讨论 总结 参考文献 缩略词表 攻读学位期间成果 致谢 |
（5）表达丙型肝炎病毒（HCV）截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 结 果 |
| 1 HCV重组腺病毒rAd5-C44P的制备与鉴定 |
| 2 ELISA检测重组腺病毒rAd5-C44P的体液免疫反应 |
| 3胞内细胞因子染色 (Intracellular cytokine staining,ICS)检测rAd5-C44P两针免疫后的细胞因子产生情况 |
| 4重组腺病毒rAd5-C44P的免疫保护效果 |
| 讨 论 |
（6）丙型肝炎疫苗最新研究进展——挑战与希望并存（论文提纲范文）
| 1 丙肝疫苗研发的可能性 |
| 2 模型系统与 HCV疫苗 |
| 3 丙型肝炎候选疫苗 |
| 4 丙型肝炎研发的挑战 |
| 5 结语 |
（8）卵清蛋白免疫耐受因子免疫学活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 免疫耐受的研究进展 |
| 1.1 免疫耐受的发现 |
| 1.1.1 中枢免疫耐受的发现 |
| 1.1.2 外周免疫耐受的发现 |
| 1.2 外周免疫耐受与人类重大疾病、动物疫病的关系 |
| 1.2.1 外周免疫耐受与自身免疫病 |
| 1.2.2 外周免疫耐受与移植免疫 |
| 1.2.3 外周免疫耐受与病毒性疾病 |
| 1.2.4 外周免疫耐受与肿瘤病 |
| 1.3 外周耐受的人工诱导 |
| 1.3.1 抗原诱导的外周免疫耐受 |
| 1.3.2 耐受转移诱导的外周免疫耐受 |
| 1.3.3 T 细胞疫苗诱导外周免疫耐受 |
| 1.3.4 外周免疫耐受的鉴定 |
| 1.4 外周免疫耐受形成和维持机制 |
| 1.4.1 调节性T 细胞与外周免疫耐受 |
| 1.4.2 树突状细胞与外周免疫耐受 |
| 1.4.3 外周免疫耐受的其他机制 |
| 1.5 本研究的内容和目的意义 |
| 第二章 小鼠OVA 外周免疫耐受的诱导及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物及其分组 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要溶液 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 尾静脉注射OVA 诱导外周耐受 |
| 2.2.2 初次免疫及再次免疫 |
| 2.2.3 脾淋巴细胞悬液的制备 |
| 2.2.4 淋巴细胞增殖试验 |
| 2.2.5 流式分析 |
| 2.2.6 显着性检验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 脾脏淋巴细胞对OVA 特异性刺激的增殖反应 |
| 2.3.2 脾脏CD4~+CD25~+ T 细胞亚群比例的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 小鼠OVA 免疫耐受因子转移耐受活性的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要溶液 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 尾静脉注射OVA 诱导外周耐受 |
| 3.2.2 不同分子量范围耐受小鼠脾细胞裂解液的制备 |
| 3.2.3 OVA 免疫耐受小鼠脾淋巴细胞悬液的制备 |
| 3.2.4 OVA 免疫耐受因子(OVA ITFs)的制备 |
| 3.2.5 不同分子量范围的耐受小鼠脾细胞裂解液转移免疫耐受效果的检测 |
| 3.2.6 OVA ITFs 转移免疫耐受效果检测 |
| 3.2.7 淋巴细胞增殖试验 |
| 3.2.8 迟发型超敏反应（DTH）检测 |
| 3.2.9 流式分析 |
| 3.2.10 细胞因子测定 |
| 3.2.11 显着性检验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同分子量范围耐受小鼠脾细胞裂解液对特异性淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 OVA ITFs 对受体鼠外周 CD4+CD25+ T 细胞亚群比例的影响 |
| 3.3.3 OVA ITFs 对受体鼠抗原特异性迟发型超敏反应(DTH)的影响 |
| 3.3.4 OVA ITFs 对受体鼠抗原特异性淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.3.5 OVA ITFs 对受体鼠细胞培养上清中 TGF-β1 分泌水平的影响 |
| 3.3.6 OVA ITFs 对受体鼠细胞培养上清中 IL-10 分泌水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 不同分子量范围的耐受小鼠脾细胞裂解液转移免疫耐受的活性 |
| 3.4.2 OVA ITFs 转移免疫耐受的活性 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）HCV E2蛋白促进B淋巴细胞活化和增殖的机制及E2蛋白突变体免疫原性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 第一部分 HCV E2 蛋白促进B 淋巴细胞活化和增殖的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HCV E2 蛋白突变体免疫原性分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）T细胞疫苗对BXSB鼠外周血CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞及Foxp3基因的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 T细胞疫苗对BXSB鼠CD4~+CD25~+T细胞的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 参考文献 |
| 第二章 T细胞疫苗对BXSB鼠Foxp3基因的影响及其与CD4~+CD25~+T细胞的相关分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 参考文献 |
| 第三章 T细胞疫苗对BXSB鼠CD8~+CD28~+T细胞的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录1 英文缩写词对照表(Abbreviation) |
| 附录2 综述 |
| 攻读期间成果 |
| 致谢 |
四、T细胞疫苗对HCV的清除作用（论文参考文献）
- [1]从丙型肝炎疫苗研发看HCV感染后T细胞介导的免疫反应[J]. 刘柯慧,王晖. 肝脏, 2021(03)
- [2]基于病毒全蛋白组序列筛选T细胞表位研发新型寨卡病毒T细胞疫苗[D]. 郑智航. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
- [3]人/大鼠异源HER2特异性囊泡靶向的T细胞疫苗对HER2+乳腺癌免疫治疗的研究[D]. 胡青青. 苏州大学, 2018(12)
- [4]HCV腺病毒载体疫苗AdNSmut的构建和免疫评价[D]. 王一琳. 南方医科大学, 2017(01)
- [5]表达丙型肝炎病毒（HCV）截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析[J]. 管洁,邓瑶,陈红,杨扬,文波,谭文杰. 病毒学报, 2015(01)
- [6]丙型肝炎疫苗最新研究进展——挑战与希望并存[J]. 李婷婷,殷森,黎诚耀. 现代免疫学, 2015(01)
- [7]丙型肝炎疫苗的研究进展与挑战[J]. 刘文宇,戚中田. 国际生物制品学杂志, 2010(04)
- [8]卵清蛋白免疫耐受因子免疫学活性的研究[D]. 马晓红. 西北农林科技大学, 2009(S2)
- [9]HCV E2蛋白促进B淋巴细胞活化和增殖的机制及E2蛋白突变体免疫原性分析[D]. 任艳丽. 第二军医大学, 2009(10)
- [10]T细胞疫苗对BXSB鼠外周血CD4+CD25+T细胞、CD8+CD28+T细胞及Foxp3基因的影响[D]. 钱芳. 南方医科大学, 2008(06)