论文摘要
背景肺癌是严重危害人类的恶性肿瘤,它是目前世界上发病率和死亡率最高的肿瘤之一,肺癌死亡率高的主要原因是缺乏有效的早期诊断手段。发现早期肺癌的特异性诊断标志物,并且能应用于早期肺癌的诊断,是提高肺癌患者生存率的一条有效途径。近年来,DNA甲基化与肿瘤形成相关性方面的研究取得了许多进展。大量的研究成果证实,抑癌基因失活和随后引起的癌基因激活与肿瘤的发生有关,抑癌基因的失活或者表达降低可以促使细胞向恶性表型转变。目前认为抑癌基因启动子的甲基化在一些肿瘤（如肺癌）中起到主导作用,并且有可能在这些肿瘤发生的早期就可以被检测出。近年的研究表明,肺癌患者的组织中p16、APC、RASSF1A和DAPK等基因启动子会发生异常的甲基化。循环DNA（circulating DNA）,又称为游离DNA（cell-free DNA）,是存在于血液（血浆或血清）、脑脊液以及滑膜液等体液中的细胞外DNA。肿瘤患者血浆中DNA含量增高,主要来源于肿瘤细胞。APC基因为家族性腺瘤样结肠息肉病的易感基因,位于染色体5q21。本研究组在以前的研究中发现在肺癌组织中APC基因的启动子区会发生高甲基化,并且对肺癌诊断可能具有一定的价值。肺癌组织的获得比较困难,因此若能在早期肺癌患者血浆中检测到这种甲基化改变并进行定量,这将有助于肺癌早期诊断。同时,如能对肺癌患者血浆中APC基因甲基化进行定量检测,则还可对肺癌的临床治疗预后及复发等方面的跟踪监测提供帮助。目的建立血浆APC基因甲基化实时荧光定量MSP检测方法;以临床未明确诊断的肺部实体瘤患者为研究对象,用实时荧光定量MSP检测其血浆中APC基因甲基化并与临床病理检查的结果进行比较,以确定本检测是否有助于早期肺癌的诊断。方法将已知APC基因启动子区甲基化阳性大细胞肺癌细胞株NCI-H460进行有限稀释,获取单个集落形成的细胞,消化收集细胞。以酚/氯仿法提取细胞DNA,同时用MSP和亚硫酸氢盐测序法对APC基因启动子区甲基化状态进行验证。将肿瘤细胞DNA用紫外分光光度计定量后,分别制备浓度为1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、15拷贝肿瘤细胞基因组DNA/ml血浆。利用磁珠核酸提取方法对模拟肺癌患者血浆样本进行血浆DNA提取,以转甲基后的CBDNA作为阳性对照,以未转甲基的脐带血DNA（CB DNA）作为阴性对照,然后对模拟肺癌患者血浆DNA、阳性对照和阴性对照行亚硫酸氢盐化学修饰,采用自行设计的针对APC启动子的引物和探针进行扩增。以定量投入肿瘤DNA的血浆作为标准品血浆,以标准品血浆DNA的扩增结果制定标准曲线。对该方法特异性、准确性、重复性、敏感性进行评价,同时确定最低检测限。收集92例在放射科行CT引导肺部穿刺的肺部实体瘤患者的血浆,同时收集23例健康体检者血浆作为阴性对照,采用磁珠法进行血浆DNA提取。采用已知APC基因启动子区甲基化阳性的肺癌细胞株NCI-H460的DNA作为阳性对照,将血浆DNA、阳性对照和阴性对照同步进行亚硫酸氢盐化学修饰,采用上述建立的实时荧光定量MSP方法进行扩增检测。结果NCI-H460细胞株的APC基因存在高甲基化;肿瘤DNA浓度分别为1.5×105、1.5×104、1.5×103和1.5×102拷贝/ml的标准品血浆有扩增,实时荧光定量MSP最低可以检测到血浆中1.5×102拷贝/ml甲基化的肿瘤细胞的DNA。以标准品肿瘤DNA的模拟血浆扩增Ct值与初始浓度的对数值作标准曲线。根据定量计算公式CAPC=10（Ct-截距）/斜率就可以对待测样本中甲基化APC基因的浓度进行计算。以扩增Ct值的结果统计,批内CV和批间CV分别为0.91%和2.43%。92例肺部实体瘤患者,经病理学诊断,58例确诊为肺癌、31例为肺部良性疾病、3例未明确诊断;58例肺癌患者中有14例血浆APC基因启动子甲基化阳性,阳性率为24.1%（14/58）,其中最高浓度为6.78×103拷贝/ml,最低浓度为1.67×102拷贝/ml,中位浓度为1.60×103拷贝/ml,31例肺部良性疾病、3例未明确诊断和23例健康者的血浆APC基因启动子甲基化均为阴性。结论本研究中所建立的实时荧光定量MSP,具有检测线性范围宽、敏感性高、特异性强及重复性好的优点,可以用于血浆中微量APC基因启动子甲基化的定量检测;对肺部实体瘤患者的血浆APC基因启动子甲基化定量检测,结果提示该方法对早期肺癌诊断可能具有重要的临床应用价值。
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