论文摘要
糖尿病（Diabetes mellitus, DM）是由绝对或者相对的胰岛素不足所造成的疾病,血糖升高（Hyperglycemia）是糖尿病的主要特点之一。糖尿病是心血管疾病重要的危险因素,其中血糖异常是糖尿病血管并发症发生的重要原因之一。高糖引起的血管内皮形态改变和功能异常,是糖尿病血管并发症的早期标志。研究已表明,高糖诱发的氧化应激是导致血管内皮损伤的主要原因。氧化应激（Oxidative stress）是指机体在遭受各种有害刺激时体内高活性分子如活性氧自由基（Reactive oxygen species, ROS）和活性氮自由基（Reactive nitrogen species, RNS）的产生过多,氧化程度超出抗氧化系统对氧化物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。机体内有多种酶体参与了ROS的生成,如NADPH氧化酶（NADPH oxidase, NOX）、黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase）、线粒体呼吸链酶复合体、内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase, eNOS）及脂氧合酶（Lipoxygenase, LOX）等,研究认为NOX是血管内生成ROS的主要酶体。吞噬型NADPH氧化酶是由多个亚基组成的酶复合体,包括胞膜组分：细胞色素b558（gp91PHOX和P22PHOX）和胞浆组分：p47PHOX、p67PHOX及Rac（小的GTP结合蛋白）共五个亚组分。gp91PHOX（有NADPH、heme、FAD的潜在结合位点）和p22PHOX是NOX的酶促核心,它们受p47PHOX及Rac的调节。现已发现NOX的同源家族有NOX1、NOX2（gp91PHOX）. NOX3、NOX4、NOX5、 Duox1（Dual oxidase1）和Duox2等成员,在血管内皮细胞主要表达NOX2和NOX4,且NOX4表达水平比NOX2高20倍。进一步的研究显示,血管内皮细胞产生的ROS主要来源于NOX4。NOX活性受其亚组分p47PHOX和Rac-1的调节。p47PHOX磷酸化之后,从胞浆转到胞膜上与细胞色素b558结合,在Rac-1的参与下激活NOX。为了探讨高糖引起血管内皮细胞氧化应激的作用机制,我们用高浓度（20mmol/L）葡萄糖处理人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,通过流式细胞术检测ROS水平的改变。结果显示,与正常培养条件相比,20mmol/L葡萄糖处理的HUVECs中ROS水平显著升高。分别用几个产生ROS途径的抑制剂DPI、Rotenone、Oxypurinol和L-NAME预处理后,NOX抑制剂DPI组ROS水平显著降低,而其他抑制剂组的ROS水平无明显变化。提示NOX是高葡萄糖诱导HUVECs产生ROS的主要来源。进一步应用RT-PCR、 Real-time PCR和Western blot分析NOX亚组分表达的变化。结果表明,]HUVECs表达NOX4及其亚组分p22PHOX、p47PHOX、p67PHOX和Rac-1。NOX4的表达在20mmol/L葡萄糖处理后显著升高,其它亚组分则无显著性改变。同时,我们应用SuperArray公司的第二代功能分类基因芯片技术对葡萄糖处理后HUVECs氧化应激与抗氧化相关基因的表达进行了检测。结果显示,20mmol/L葡萄糖引起氧化应激与抗氧化相关部分基因的表达升高或者降低,其中值得注意的是,与对照组相比,Dual oxidase2基因表达升高近13倍,而Superoxide dismutase3基因表达水平明显降低。观察葡萄糖对NOX4活性的调节机理的结果表明,在高浓度葡萄糖条件下,HUVECs的NOX4活性调节主要发生在两个水平上,一是通过PKC激活NOX4,二是通过p47PHOX和Rac-1的膜移位来调节NOX4的活性。为了研究NOX4表达水平的改变对ROS产生的影响及其对HUVECs损伤的作用,我们采取“失去功能”和“获得功能”两种策略,分别将NOX4-siRNA或NOX4基因转染入HUVECs,获得极低表达甚至无表达或高表达NOX4水平的HUVECs。分析比较这些内皮细胞和对照内皮细胞（未转入NOX4-siRNA和NOX4）中ROS水平与细胞凋亡。我们的实验结果表明,与未转染质粒的对照组和转染GFP质粒表达质粒组相比,转染NOX4质粒组的HUVECs中ROS明显升高（p<0.05）；流式细胞术、Hoechst染色和TUNEL染色结果均显示,转染NOX4质粒组的HUVECs发生明显凋亡（p<0.05）。高糖处理HUVECs之后,其NOX4mRNA水平升高,ROS产量增加,细胞凋亡的比例也增多,而经NOX4-siRNA转染抑制NOX4表达后,高糖所引起的ROS升高和凋亡均受到抑制。说明NOX4参与了高糖引起内皮细胞内ROS的生成和细胞凋亡。在此基础上,我们对NF-κB （nuclear factor-κ B）和p38MAPK信号通路在高糖诱导内皮细胞凋亡中的作用进行探讨。结果显示,20mmol/L葡萄糖处理HUVECs后,伴随ROS的升高,磷酸化的IκB和NF-κB均增多,IκB失去对NF-κB的抑制作用,NF-κB移位至细胞核内。另外,我们还发现,与对照组相比,葡萄糖处理组炎症相关因子ICAM-1、VCAM-1的表达均明显增强（p<0.05）。这些结果提示,高糖可以诱导ROS的升高,引起NF-κB的活化,使得炎症相关因子的表达增加。p38MAPK是细胞内重要的信号转导通路,参与内皮细胞凋亡的调节。研究已表明,高糖可导致p38MAPK的磷酸化从而进入细胞核启动下游信号通路的转录。我们用20mmol/L葡萄糖及p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理HUVECs,用Western blot检测p38MAPK及磷酸化的p38MAPK （P-p38MAPK）的水平。结果显示,与正常对照组相比,葡萄糖处理组p38MAPK的表达无明显变化,而P-p38MAPK的水平明显升高（p<0.05）；与葡萄糖处理组相比,SB203580能明显抑制高糖所致P-p38MAPK的升高（p<0.05）,而对p38MAPK的表达并无影响。Hoechst/PI染色、TUNEL和PI/Annexin V-FITC双染法的结果表明,SB203580预处理明显抑制葡萄糖引起的细胞凋亡。这些结果提示,p38MAPK在高糖诱导HUVECs凋亡的过程中起着重要的调节作用。近年研究提示,他汀类药物除了有降胆固醇的作用之外,还具有抗炎、抗氧化和稳定斑块的作用。我们在前期的研究中发现,辛伐他汀处理HUVECs能下调NOX4mRNA水平,但不影响NOX2的表达。高浓度（0.8g/L） LDL刺激HUVECs时,NOX4表达上调,细胞内ROS生成增加。用辛伐他汀预处理再加高浓度LDL刺激时,NOX4表达下降,ROS生成量减少。提示辛伐他汀可下调HUVECs NOX4表达,降低ROS水平。为了进一步在体内证明辛伐他汀的抗氧化作用,我们建立了Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型,并用辛伐他汀进行干预。结果显示,与对照组小鼠相比,辛伐他汀能够明显降低Apo E-/-小鼠血液中TG和MDA,也降低动脉粥样硬化斑块的ROS水平和NOX亚组分的表达。此外,辛伐他汀干预后,动脉粥样硬化斑块变小,纤维帽的厚度和完整性得到明显改善。提示辛伐他汀可能起到稳定斑块的作用。综上所述,本研究得出以下结论：1、高浓度（20mmol/L）葡萄糖主要通过上调NOX4的表达和活性显著提高]3UVECs的ROS水平；2、20mmol/L葡萄糖处理HUVECs引起氧化应激相关基因Dual Oxidase2表达升高近13倍,而Superoxide dismutase3基因表达水平明显降低；3、葡萄糖通过激活PKC和引起p47PHOX和Rac-1膜移位促进NOX4的活化；4、高浓度葡萄糖和NOX4过表达均可引起HUVECs凋亡,而干扰NOX4的表达可以抑制高糖引起的HUVECs凋亡;5、p38MAPK的磷酸化在高糖引起的HUVECs凋亡过程中发挥重要作用；6、葡萄糖能促进NF-κB的活化及其下游靶基因ICAM-1和VCAM-1的表达；7、辛伐他汀可能通过减少NOX亚组分的表达降低动脉硬化小鼠模型血管的氧化应激水平。本研究为探寻保护血管内皮细胞免受高糖状态下的氧化损伤提供新的线索。特异性抑制NOX活性可能成为防治糖尿病血管并发症的新靶点。