锯缘青蟹一种新的阴离子抗菌肽scygonadin及其基因的分离与鉴定

论文摘要

锯缘青蟹Scylla serrata （Forsk?l,1775）是我国最重要的海水养殖经济蟹类之一。本论文运用液相色谱技术分离纯化获得一种新抗菌肽,命名为Scygonadin,利用分子生物学技术克隆获得Scygonadin全长基因序列,利用生物信息学的方法阐明其基因结构,运用分子生物学的方法分析该基因在锯缘青蟹体内各组织器官中的转录表达情况等,为阐明锯缘青蟹的先天性免疫及生殖免疫机制奠定基础。通过研究获得了如下结果:1、分离纯化获得一种新抗菌肽。以锯缘青蟹的精液为材料,通过酸性溶液萃取,联合利用阳离子交换层析和反相高效液相层析技术进行分离纯化,获得一种单成份,Tricine-SDS-PAGE测定其分子量约为10.8 kDa。胰蛋白酶裂解该多肽后,用MALDI-ToF-MS法分析了肽指纹图谱。Edman降解法测定其N-端20个氨基序列为H-GQALNKLMPKIVSAIIYMVG-OH,BLAST进行数据库检索,发现与已知抗菌肽的同源性很低,是一种新的抗菌肽,由于从Scylla serrata的雄性生殖腺中获得,具有抗菌活性,故命名为Scygonadin。2、克隆获得Scygonadin全长cDNA序列。利用简并反转录-聚合酶链式反应（Degenerated RT-PCR）和快速扩增cDNA末端（RACE）技术,克隆获得了Scygonadin全长cDNA序列,并登录GenBank数据库,登录号:AY864802。Scygonadin cDNA全长539 bp （不包括poly A）,其中5’非翻译区56 bp、蛋白质编码区381 bp（包括终止密码子TAA）和3’非翻译区102 bp。3’非翻译区包括保守的信号序列（AATAAA）,其后紧接着16个非腺苷酸序列和多聚腺苷酸序列。推导的全长氨基酸含有126个氨基酸残基,由信号肽（24个氨基酸残基）和成熟肽（102个氨基酸）两部分组成。成熟肽平均分子量为11271.82 Da,pI为6.09,为阴离子抗菌肽。在甲壳动物中尚未见阴离子抗菌肽的报道。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 第一节抗菌肽的分类
• 1.1 阳离子抗菌肽
• 1.2 阴离子抗菌肽
• 1.3 源自神经肽前体的抗菌肽
• 1.4 芳香二肽
• 1.5 氧结合蛋白及其他大蛋白质裂解肽段
• 第二节 抗菌肽的作用机理
• 2.1 跨膜孔的形成机制
• 2.2 细胞内的杀菌机制
• 第三节 甲壳动物抗菌肽研究进展
• 3.1 甲壳动物宿主防御体系
• 3.2 甲壳动物的相关抗菌活性研究
• 3.3 甲壳动物抗菌肽研究进展
• 3.4 甲壳动物抗菌肽研究展望
• 第四节 本研究的技术路线、目的和意义
• 4.1 技术路线
• 4.2 研究的目的和意义
• 第二章 锯缘青蟹抗菌肽Scygonadin 的分离纯化和鉴定
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果
• 2.1 抗菌肽的分离
• 2.2 抗菌肽Scygonadin 的鉴定
• 2.3 抗菌活性
• 第三节 讨论
• 3.1 Scygonadin 是一种新抗菌肽
• 3.2 Scygonadin 是一个两亲的分子
• 3.3 Scygonadin 的抑（杀）菌活性
• 3.4 锯缘青蟹体内广泛存在抗菌活性物质
• 第三章 Scygonadin 基因的克隆和序列分析
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节 结果
• 2.1 总RNA 提取
• 2.2 3'和5'RACE 结果
• 2.3 Scygonadin 全长cDNA 序列及分析
• 2.4 Scygonadin 基因结构
• 2.5 Scygonadin 成熟肽氨基酸序列的质谱鉴定
• 2.6 Scygonadin 2 的氨基酸序列分析
• 2.7 Scygonadin 的次级结构及其重要结构域
• 第三节讨论
• 3.1 Scygonadin 是一种两亲的新阴离子抗菌肽
• 3.2 Scygonadin 成熟肽的肽指纹图谱鉴定分析
• 第四章 Scygonadin 基因在锯缘青蟹体内的表达特性研究
• 第一节 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 第二节结果
• 2.1 标记探针用的基因片段的获得
• 2.2 探针标记效率的测定结果
• 2.3 Scygonadin 基因青蟹幼体中的表达
• 2.4 Scygonadin 基因在雄性锯缘青蟹中的表达
• 2.5 Scygonadin 基因在雌性锯缘青蟹中的表达
• 2.6 Scygonadin 基因在远洋梭子蟹中的表达
• 第三节讨论
• 3.1 Scygonadin 基因主要在雄性生殖腺中转录表达
• 3.2 Scygonadin基因不在青蟹幼体中表达
• 结语
• 1 主要成果
• 1.1 分离纯化获得一种新抗菌肽。
• 1.2 获得Scygonadin全长cDNA序列。
• 1.3 阐明Scygonadin的基因结构。
• 1.4 揭示了Scygonadin基因主要在雄性生殖系统中特异性转录表达。
• 2 创新之处
• 2.1 首次发现了甲壳动物生殖腺中的一种阴离子抗菌肽
• 2.2 首先获得了 Scygonadin 氨基酸和核苷酸序列,并阐明其基因结构
• 2.3 首次发现了甲壳动物的生殖系统中特异性表达的抗菌肽基因
• 3 展望
• 3.1 Scygonadin 抗菌作用机理
• 3.2 Scygonadin 基因的诱导表达机制及其在锯缘青蟹繁殖中的作用
• 参考文献
• 在学期间参加的科研项目及成果
• 一、参加与本论文直接相关的科研项目
• 二、发表论文
• 三、申请专利
• 四、获奖情况
• 致谢