论文摘要
目的：明确甘氨酸受体（Glycine receptor，GlyR）介导甘氨酸细胞保护作用的下游信号通路，阐明甘氨酸拮抗细胞ATP耗竭性损伤的分子机制，为发现新型细胞保护剂提供理论依据。方法：本研究首先使用呼吸链抑制剂联合无糖培养基共同作用复制细胞ATP耗竭模型。将犬肾细胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）分为ATP耗竭组和Gly（Glycine）保护组，运用Western blot检测ERK1／2、p38MAPK、JNK1／2和AKT的磷酸化活性变化。分别运用ERK1／2和AKT的阻断剂PD98059、LY294002，观察各组LDH释放率的变化。将构建好的pcDNA3.1-GlyRal真核表达载体，应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入野生型人胚肾细胞（Humanembryonic kidney 293，HEK293），再用G418筛选稳定的细胞表达系。将稳定表达细胞系和野生型HEK293细胞处于ATP耗竭和Gly保护状态下，运用Western blot检测ERK1／2、p38MAPK、JNK1／2和AKT的磷酸化活性变化。选用使MDCK细胞中GlyRal表达下调最明显的siRNA2，脂质体法转染入MDCK细胞，于转染后48小时使其处于ATP耗竭状态，运用Western blot观察siRNA2对GlyRα1表达的抑制效果，并运用Western blot检测ERK1／2、p38MAPK、JNK1／2和AKT的磷酸化活性变化。结果：MDCK细胞处于ATP耗竭状态下15min、30min、1h、2h后，Gly保护组与ATP耗竭组相比，ERK1／2、AKT的磷酸化活性均增强，p38MAPK的磷酸化活性减弱，而JNK1／2的磷酸化活性没有变化。分别加入阻断剂PD98059和LY294002以后，Gly保护组的LDH释放率与对照组相比均有升高。将稳定表达GlyRα1的HEK293细胞和野生型HEK293细胞处于ATP耗竭状态1h。稳定表达细胞系中，Gly保护组与ATP耗竭组相比，ERK1／2、AKT的磷酸化活性均增强，p38MAPK的磷酸化活性减弱，JNK1／2的磷酸化活性没有改变。野生型HEK293细胞中，Gly保护组和ATP耗竭组相比，ERK1／2、p38MAPK、JNK1／2和AKT的磷酸化活性均没有明显改变。siRNA2转染入MDCK细胞48h后，MDCK细胞中的GlyRα1的蛋白表达水平明显下降达60％以上，达到实验的要求。处于ATP耗竭状态1h后，Western blot显示正常组和空转组中，Gly保护组与ATP耗竭组相比，ERK1／2、AKT的磷酸化活性增强，p38MAPK的磷酸化活性减弱，JNK1／2的磷酸化活性没有变化；而在干扰组中，Gly保护组与ATP耗竭组细胞相比ERK1／2、p38MAPK、JNK1／2和AKT的磷酸化活性均无明显变化。结论：ERK1／2、p38MAPK、AKT是甘氨酸受体细胞保护作用的下游途径。甘氨酸与GlyR结合以后，通过增加ERK1／2、AKT的磷酸化活性；同时抑制p38MAPK的磷酸化活性，从而发挥保护细胞的作用。