特发性血小板减少性紫癜中IDO和BAFF异常及其在诱导免疫耐受中的作用研究

论文摘要

第一部分CTLA4-Ig可纠正ITP患者IDO介导的色氨酸代谢异常研究背景：特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP）是一种由自身反应性B细胞和T细胞克隆介导的获得性自身免疫性疾病,对血小板自身抗原的免疫耐受遭到破坏,导致免疫介导的血小板破坏及血小板生成障碍。本病发病机制包括抗原递呈细胞、T细胞和B细胞之间复杂的相互作用,至今尚未完全阐明。吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）是细胞内的一种催化色氨酸分子沿犬尿酸途径进行分解代谢的限速酶。色氨酸是人体内的必需氨基酸,缺乏可导致细胞功能异常,而色氨酸代谢产物犬尿氨酸能够诱导T细胞凋亡。因此,IDO也是一种重要的免疫调节酶。IDO主要表达在树突状细胞和胎盘细胞,IDO+DC能够抑制T细胞活化与增殖,促进T细胞的凋亡,诱导调节性T细胞。近年来的研究发现,在许多自身免疫性疾病中存在着IDO介导的色氨酸分解代谢作用的异常,如多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、弥漫性毒性甲状腺肿、以及类风湿性关节炎等。IDO最初是以一种无活性的酶原形式表达,其活化还需要另外的刺激信号,B7-1／B7-2分子与树突细胞（dendritic cells,DCs）CTLA4/CD28的结合是活化IDO酶的重要条件,这种结合断开时,IDO处于未活化状态,无法抑制T细胞增殖。重组人CTLA-4-Ig Fc融合蛋白,与共刺激分子B7-1、B7-2具有高度亲和力,可诱导功能性IDO在树突细胞的表达,使T细胞微环境色氨酸缺乏,从而阻断T细胞活化与增殖。除此之外,CTLA-4-Ig诱导后的树突细胞IDO还可以提高Treg细胞的比例,进而抑制效应性T细胞活性,诱导免疫耐受。研究目的：（1）检测ITP患者体内IDO表达及其活性变化。（2）CTLA-4-Ig体外诱导ITP患者外周血树突细胞表达具有酶活性的IDO,检测其表达及活性变化。（3）通过检测IDO+DC对T细胞增殖、活化、凋亡以及调节性T（Treg）细胞的影响,研究IDO+DC的致免疫耐受作用。研究对象与方法：（1）病例及正常对照的选择：慢性活动性ITP患者45例,血小板计数（136）×109／L,中位血小板数13×109／L。所有患者均符合慢性ITP的诊断标准,均不伴有糖尿病、高血压、消化道溃疡及结核等急慢性感染性疾病。正常对照来自于20例健康志愿者,血小板计数（126～287）×109／L,中位197×109／L。无感染、无病毒性肝炎、无免疫性疾病及半年内未使用免疫抑制剂、抗HIV抗体阴性、肝肾功能正常,其年龄和性别均与ITP患者相匹配,（2）从ITP患者外周血中分离单个核细胞（PBMCs）,用GM-CSF、IL-4培养7d,培养后的未成熟DCs用TNF-α,IL-6,IL-1β,PGE2等培养2d。将培养后的成熟DCs分为2组：加入CTLA-4-Ig（10μg／ml）培养者为组1；未加入CTLA-4-Ig（0μg／ml）培养者为组2。（3）流式细胞术检测PBMCs和成熟DCs中IDO的表达率,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IDO mRNA的表达,蛋白印迹法（Western blot）检测IDO蛋白的表达。（4）高效液相色谱法（HPLC）检测ITP患者和正常对照色氨酸（Trp）及其特异代谢产物犬尿氨酸（Kyn）的浓度,以判断IDO活性。（5）将诱导后的两组DCs分别与患者血小板特异性T淋巴细胞组成混合淋巴细胞反应（MLR）体系,检测体系中T淋巴细胞增殖率,流式细胞术检测T淋巴细胞活化、凋亡情况及Treg细胞的比例。结果：（1）ITP患者血浆色氨酸浓度明显高于正常对照（110.00±19.60 pg／ml vs.39.24±8.50 pg／ml,P<0.01）,犬尿氨酸浓度明显低于正常对照（56.31±20.63 pg／mlvs.122.70±33.00 pg／ml,P<0.01）。（2）ITP患者IDO mRNA的相对表达量为正常对照的70.96倍（P<0.01）。PBMCs中CD14+细胞IDO表达的平均荧光强度（MFI）明显高于正常对照（684.50±273.00 vs.220.90±169.90,P<0.01）。体外诱导法培养树突细胞,ITP患者DCs中IDO MFI明显低于正常对照（124±23.10 vs.376.9±28.00,P<0.01）。（3）诱导法培养成熟DCs,组1（CTLA-4-Ig 10μg／mL）与组2（CTLA-4-Ig0μg／mL）的IDO+DC比例均>90%。组1中IDO mRNA的相对表达量为组2的36.80倍（P<0.01）。组1中IDO MFI明显高于组2（124±23.10 vs.401±44.91,P<0.01）。组1培养上清中犬尿氨酸浓度明显高于组2（178.8±17.58pg／ml vs.80.71±6.64 pg／ml,P<0.05）。向组1中加入1-MT,上清中犬尿氨酸浓度明显降低（39.15±10.94pg／ml vs.178.8±17.58pg／ml,P<0.05）。（4）CTLA-4-Ig诱导DCs功能性IDO高表达的致免疫耐受作用①功能性IDO对T细胞增殖的抑制作用：两组DCs分别与患者血小板特异性T淋巴细胞组成混合淋巴细胞反应体系,组1中T细胞增殖明显低于组2（0.4341±0.1025 vs.0.6545±0.0592,P<0.01）,加入1-MT后,IDO作用受抑制,T细胞增殖升高（0.7413±0.0378 vs.0.4341±0.1025,P<0.01）。②功能性IDO对T细胞活化的抑制作用：组1中CD3+／CD25+细胞、CD3+／CD69+和CD3+／CDT1+细胞的比例明显低于组2（22.65%±4.14%vs.31.05%±4.69%,P<0.01；8.04%±6.48%vs.14.95%±10.66%,P<0.01;24.40%±10.36%vs.31.95%±12.46%,P<0.01）。③功能性IDO对淋巴细胞凋亡的促进作用：组1中CD4+细胞,CD8+细胞和CD19+细胞Annexin V%均高于组2（21.84%±7.75%vs.13.81%±6.09%,P<0.01;10.69%±3.14%vs.7.79±2.93%,P<0.05；18.86%±9.91%vs.13.31%±9.28%,P<0.05）。④功能性IDO可诱导Treg细胞的生成：组1中Treg比例明显高于组2（5.78%±1.70%vs 2.67%±0.87%,P<0.01）。结论：ITP患者IDO的表达及酶活性均存在异常,IDO介导的色氨酸分解代谢受损是ITP重要发病机制之一。CTLA-4-Ig可以提高ITP患者DCs功能性IDO的表达,增加IDO酶活性,抑制T细胞的增殖与活化,促进淋巴细胞凋亡,提高Treg细胞比例,且以上作用为IDO依赖性。IDO介导的色氨酸分解代谢可能在ITP发病中起重要作用,并为ITP的治疗提供了新途径。第二部分大剂量地塞米松对ITP患者BAFF与Treg的影响及机制探讨研究背景：慢性特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP）是一种常见的自身免疫性出血性疾病,其发病机制涉及体液免疫和细胞免疫功能的异常。长期以来糖皮质激素一直是特发性血小板减少性紫癜的首选药物,其对细胞免疫和体液免疫均具有抑制作用,可以减少血小板自身抗体的生成,抑制单核-巨噬细胞系统对血小板的破坏,改善毛细血管通透性。近年来,大剂量地塞米松因其疗效高,用药时间短,副反应发生率低已成为ITP一线治疗用药的新选择。B细胞活化因子（B-cell activating factor belonging to TNF family, BAFF）是肿瘤坏死因子超家族的一员,对于维持B细胞稳态及体液免疫平衡起着非常重要的作用。BAFF的表达异常,可刺激B细胞增殖活化、延长自身反应性B细胞的寿命,延长浆细胞在骨髓中的生存时间,扰乱机体的免疫耐受状态。调节性T（regulatory T,Treg）细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群,在维持机体对自身抗原的耐受方面起着重要作用,其数量与功能的异常可导致自身免疫失耐受。本研究拟通过检测ITP患者大剂量地塞米松（HD-DXM）治疗前后BAFF水平和Treg细胞的比例以及变化规律,探讨二者在ITP发病中的意义及大剂量地塞米松对二者的影响。研究目的：（1）检测大剂量地塞米松治疗前后ITP患者BAFF水平的变化。（2）检测大剂量地塞米松治疗前后ITP患者Treg细胞比例的变化。（3）研究BAFF对Treg细胞的影响。研究对象与方法：（1）病例及正常对照的选择：慢性活动性ITP患者21例,均符合慢性ITP的诊断标准,排除ITP患者合并有病毒性肝炎、糖尿病、高血压、心血管疾病、妊娠、活动性感染或者结缔组织病者。治疗前,血小板计数1～34×109／L,中位19×109／L。所有患者均给予地塞米松40 mg／天口服治疗,连用4天,治疗2周后血小板计数55～267×109／L,中位153×109／L。正常对照来自于20例健康志愿者,血小板计数134～297×109／L,中位197×109／L,无感染、无病毒性肝炎、无免疫性疾病及半年内未使用免疫抑制剂、抗HIV抗体阴性、肝肾功能正常,其年龄和性别均与ITP患者相匹配。（2）用ELISA法检测ITP患者治疗前后血浆BAFF水平。（3）流式细胞术检测ITP患者治疗前后Treg细胞的比例。（4）体外培养ITP患者及正常对照外周血单个核细胞（PBMCs）：加入rhBAFF（20mg／ml）培养者为rhBAFF20组；未加入rhBAFF培养者为rhBAFF0组。检测BAFF对Treg细胞的影响。结果：（1）治疗前,ITP患者的BAFF水平较正常对照明显升高（599.70±199.40pg／ml,454.40±132.50pg／ml,P<0.05）,Treg细胞比例明显降低（1.56%±0.73%,4.08%±1.08%,P<0.01）。（2）大剂量地塞米松治疗后,ITP患者的BAFF水平明显下降（296.90±119.70pg／ml vs.599.70±199.40pg／ml,P<0.01）,且低于正常对照组（296.90±119.70pg／ml vs.454.40±132.50pg／ml,P<0.01）；Treg细胞比例明显升高（5.94%±2.22%vs.1.56%±0.73%,P<0.01）,且高于正常对照（5.94%±2.22%vs.4.08%±1.08%,P<0.01）。（3）ITP患者BAFF水平和Treg比例与血小板计数无相关性（r=0.1108,P>0.05;r=0.0224,P>0.05）。（4）体外试验显示,rhBAFF0组和rhBAFF20组Treg数量无明显改变（1.53±0.69%vs.1.49±0.67%,P=0.89）。结论：在慢性活动性ITP患者,BAFF水平增高,Treg细胞数量减少。大剂量地塞米松治疗可降低患者的BAFF水平,增加Treg细胞的数量。BAFF对Treg细胞无明显影响。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 CTLA4-Ig可纠正ITP患者IDO介导的色氨酸代谢异常
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图（表）
• 参考文献
• 第二部分 大剂量地塞米松对ITP患者BAFF及Treg的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图（表）
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
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