论文摘要
目的：制备胰腺组织特异性Grb1O基因敲除小鼠并确定其基因敲除表型方法用flox-loxp技术制备Grb10flox/-小鼠,并通过传代以及杂合子交配得到Grb10loxp+/+小鼠,与PDX-Cre+/-小鼠交配,得到胰腺组织特异性Grb10基因敲除小鼠（下称"pGrb10 KO小鼠”）以及Grb10flox/-小鼠（下称“野生型小鼠”）作为对照组。从各个主要组织中提取DNA并用Southern Blot以及PCR方法在DNA层面确定Grb10基因敲除情况。用Western Blot以及免疫组化的方法从蛋白层面了解Grb10基因敲除情况以及蛋白表达情况。结果Southern Blot显示Grb10flox/-小鼠基因标记位置正确,PCR显示在各个组织中,基因敲除仅发生在胰腺,其他组织没有影响。Western Blot显示,野生型小鼠体内Grb10在胰腺中表达量最高,在基因敲除小鼠中Grb10蛋白被完全敲除；比较pGrb10 KO小鼠和野生型小鼠,其他各组织中的Grb10蛋白表达量没有改变。免疫组化显示,Grb10在胰腺各种细胞中都有表达,在胰岛中表达量相对较高,但在pGrb10 KO小鼠胰腺中Grb10蛋白完全无表达。结论成功制备胰腺组织特异性Grb10基因敲除小鼠,对于pGrb10 KO小鼠,Grb10蛋白在胰腺中完全敲除,在身体其他组织中没有变化。目的研究Grb10基因在beta细胞中敲除对胰岛beta细胞胰岛素释放、胰岛大小、以及血糖代谢、胰岛beta细胞增殖的影响。方法小鼠出生4周后,根据PCR结果设置pGrb10 KO小鼠组及野生型小鼠组（n=8-13）,以标准食物喂养18周,测量其体重、摄食（从第4周开始,每周一次,至22周）、以及身体脂肪比重（第22周）、身体各个器官重量。小鼠成年后实行葡萄糖耐量实验（GTT）（了解beta细胞对葡萄糖的敏感性）、胰岛素耐量实验（ITT）（了解周围组织对胰岛素的敏感性）、空腹胰岛素水平、总胰岛细胞重量。用BrdU标记法检测野生型小鼠与pGrb10 KO小鼠胰岛beta细胞增殖率的区别。结果pGrb10 KO小鼠在体重、摄食、身体脂肪比重、各个器官重量（除胰腺外）、周围组织对胰岛素的敏感性没有明显改变。pGrb10KO小鼠有更大的胰腺,较低的血糖水平以及明显增高的beta细胞增殖率,但空腹胰岛素水平以及总胰岛细胞重量无明显区别。结论与野生型小鼠比较,基因敲除小鼠血糖水平相对较低,但空腹胰岛素水平以及胰岛beta细胞团重量无明显差异。pGrb10 KO小鼠有明显升高的beta细胞增殖率。目的在2型糖尿病小鼠模型中研究Grb10基因在beta细胞中敲除对beta细胞胰岛素释放、胰岛大小、以及血糖代谢的影响方法小鼠出生4周后,根据PCR结果设置pGrb 10 KO小鼠组及野生型小鼠组（n≥10）,以60%高脂饮食喂养18周测量其体重、摄食（从第4周开始,每周一次,至22周）、以及身体脂肪比重（第22周）。实行葡萄糖耐量实验（GTT）（了解beta细胞对葡萄糖的敏感性）、胰岛素耐量实验（ITT）（了解周围组织对胰岛素的敏感性）、空腹胰岛素水平、所有胰岛细胞重量。用胰酶消化胰腺后,分离得到胰岛细胞,用IGF-1和Insulin分别刺激后,用Western Blot测定不同组小鼠p-AKT及其下游通路p-Foxo以及MAK激酶磷酸化是否改变。用透射电镜检测野生型和pGrb10 KO小鼠胰岛beta细胞内胰岛素颗粒有无区别。结果pGrb 10 KO小鼠在体重、摄食、身体脂肪比重、周围组织对胰岛素的敏感性没有明显改变。pGrb 10 KO小鼠有明显低血糖水平（与正常饮食小鼠近）以及高胰岛素水平,明显增多的胰岛beta细胞团以及胰岛beta细胞内明显增多的胰岛素颗粒。pGrb10 KO小鼠胰岛beta细胞内Akt磷酸化水平及其下游通路Foxo磷酸化水平明显上调,MAP激酶信号通路明显上调。电镜下显示pGrb10 KO小鼠胰岛beta细胞内胰岛素颗粒明显增多。结论在2型糖尿病模型中,与野生型小鼠比较,pGrb 10 KO小鼠血糖水平相对正常,胰岛素水平增高,胰岛beta细胞明显增多以及beta细胞内胰岛素颗粒明显增多。pGrb10 KO小鼠胰岛beta细胞内胰岛素信号通路明显上调,胰岛beta细胞内胰岛素颗粒明显增多。目的在糖尿病小鼠模型中研究Grb10基因在beta细胞中敲除对beta细胞胰岛素释放、胰岛大小、以及血糖代谢的影响方法选取3个月大小鼠,用STZ 75mg/kg（雄性,n=8-14）80mg/kg（雌性,n=14）注射5天后每3日在同一时间点测量血糖,体重。21天后处死小鼠,测量胰腺重量,胰岛细胞重量以及胰岛素水平。并用In Situ Cell Death Detection Kit （Roche）测定不同小鼠beta细胞凋亡情况。结果基因敲除小鼠相对对照组小鼠有明显低的血糖水平,体重维持较平稳,beta细胞明显较多,血胰岛素水平明显较高。TUNEL实验显示pGrb10 KO小鼠比野生型小鼠有明显减低的胰岛beta细胞凋亡率。结论基因敲除小鼠对STZ诱导的beta细胞凋亡有更好的抵抗作用
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