细胞内钾离子稳态参与神经细胞凋亡机制的研究

论文题目: 细胞内钾离子稳态参与神经细胞凋亡机制的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 神经生物学

作者: 陶艳梅

导师: 王以政

关键词: 磷酸化,神经传递,受体,神经细胞凋亡,细胞内钾离子浓度,结合

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 凋亡细胞内钾离子外流是除胞体皱缩,核固缩,染色体断裂等现象外的细胞凋亡的特征之一。近年来的研究发现细胞胞内钾离子浓度降低,并非以往认为的仅是凋亡进程的一个伴随结果。相反,大量工作显示细胞丢钾是凋亡进行的必要条件。钾通道阻断剂或胞外给予高钾可以阻断多种类型细胞的细胞凋亡。在神经细胞和淋巴细胞上,胞内低钾对细胞凋亡的重要性已有比较翔实的证据。但关于细胞是如何丢钾,以及细胞丢钾是如何促进细胞凋亡进程的两个重要问题仍没有很好的答案。根据丢钾的神经细胞凋亡依赖于新生蛋白合成的事实,我们探讨了胞内钾离子浓度变化与促凋亡蛋白转录调控的关系,试图找出细胞丢钾促进细胞凋亡的胞内信号转导途径。去血清处理原代培养的皮层神经元是已经建立良好的细胞丢钾会促进凋亡的神经细胞模型:已知去血清处理会导致原代培养的皮层神经元胞内丢钾,以广谱钾通道阻断剂四乙基胺(TEA)阻断外向钾电流可以阻断凋亡。这种TEA阻断钾离子外流阻止凋亡的作用不依赖于细胞膜去极化和钙离子内流,而仅仅是因为保持了细胞内的钾离子水平而实现的。利用这个丢钾促进凋亡的细胞模型,我们检测了在神经系统有多种功能的转录因子NF-κB的转录活性受细胞内钾离子浓度变化调控的可能性。通过凝胶阻滞实验(EMSAs),蛋白免疫印迹实验(Western blotting),免疫荧光细胞化学(Immnunocytochemistry)和染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)等方法,我们发现去血清可以导致神经元内NF-κB的抑制蛋白IκBα降解,促进NF-κB激活,获得DNA结合能力,并转移至核内,与NF-κB调节的靶基因启动子上结合位点结合。以TEA阻止去血清造成的细胞内钾浓度的改变并不能影响IκBα的降解,NF-κB结合DNA能力的活化,以及NF-κB核转移的过程,说明NF-κB的激活和核转移与细胞内丢钾无关。但是去血清诱导的NF-κB与其靶基因启动子上结合位点的实际结合,以及NF-κB下游基因Bcl-XS,IκBα和κB-luciferase的转录都能被阻断钾离子外流所抑制。离体EMSA

论文目录:

摘要

目录

正文

第一部分 细胞内钾离子浓度对NF-κB /DNA 结合能力的影响调节促凋亡蛋白的转录,参与血清剥夺造成的神经细胞凋亡

第一章 引言

第一节 当前细胞凋亡的研究进展

第二节 细胞内钾离子稳态与细胞凋亡

第三节 研究假说与创新

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

1.2.2.1)皮层神经元原代培养

1.2.2.2)HEK 293 细胞系培养

1.2.2.3)神经细胞内钾离子浓度变化的监测

1.2.2.4)凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assays)

1.2.2.5)蛋白免疫印迹实验(Western blotting)

1.2.2.6)免疫细胞化学(Immnocytochemistry)及Hoechst 核染色

1.2.2.7)染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)

1.2.2.8)PI 活细胞排斥染色

1.2.2.9)NF-κB 重组蛋白的原核表达和纯化

1.2.2.10)κB-luciferase 报告基因的表达检测

1.2.2.11)反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

1.2.2.12)MTT 细胞活性检测

1.2.2.13)RNA 干扰(RNA interference,RNAi)

1.2.2.14)统计与检验

第三章研究结果

第一节 去血清处理激活神经元NF-κB 活性

第二节 去血清激活的NF-κB 活性不会被TEA 阻断

第三节 TEA 阻断去血清引起的NF-κB 调节基因的表达

第四节 TEA 对NF-κB 调节基因上调的抑制作用不依赖于细胞膜去极化引起的钙内流和蛋白激酶A 的激活

第五节 TEA 抑制去血清引起的κB-luciferase 的表达,此作用不依赖于钙内流和PKA 激活

第六节 HEK 293 细胞内钾浓度的升高抑制组成型NF-κB 的活性

第七节 离体实验证实钾离子浓度直接影响去血清诱导的神经元NF-κB 结合DNA 的活性

第八节 细胞内钾离子浓度的变化影响NF-κB 与下游基因启动子上结合位点的相互作用

第九节 钾离子浓度直接影响重组NF-κB 二聚体结合DNA 的活性

第十节 钾离子浓度不影响NF-κB 二聚体之间亚基的相互作用

第十一节 钾离子浓度选择性的影响转录因子与DNA 之间的相互作用

第十二节 RNAi p65 或RNAi Bcl-X 提高神经元在去血清处理时的成活率

第十三节 NF-κB 的抑制剂有与TEA 同样的保护神经元对抗去血清处理所致凋亡的能力

第四章 研究结果分析与结论

第一节 去血清激活的NF-κB 参与神经细胞凋亡

第二节 去血清引起的细胞内低钾调节NF-κB 的转录活性

第三节 细胞内低钾对NF-κB转录活性的调节是通过钾离子对NF-κB/DNA结合的直接的特异的作用

第四节 结论

第五章 问题、思考和讨论

第二部分 神经回路活动依赖的蛋白激酶A 调节突触后Kv1.45e1229 磷酸化,可能参与神经活动对突触可塑性或神经活动依赖的神经元存活的调节

第一章 引言

第一节 神经回路活动与神经元凋亡的关系

第二节 钾通道磷酸化对其通道特性的影响

第三节 研究假说与创新

第二章实验材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

2.2.2.1)皮层神经元原代培养

2.2.2.2)HEK 293 细胞系培养

2.2.2.3)myc-Kv1.4 质粒构建

2.2.2.4)PKA 磷酸化多肽或Kv1.4 的离体蛋白激酶磷酸化实验

2.2.2.5)多克隆抗体的制备

2.2.2.6)蛋白免疫印迹实验(Western blotting)

2.2.2.7)免疫沉淀(Immunoprecipitation)及CIAP 蛋白去磷酸化实验

2.2.2.8)磷酸钙沉淀法或脂质体瞬时转染(Transient transfection)

2.2.2.9)电生理(Electrophysiology)

2.2.2.10)统计与检验

第三章研究结果

第一节 Kv1 家族高度保守的T1 区存在PKA 底物磷酸化位点的保守序列

第二节 离体实验证实PKA 磷酸化Kv1 家族T1 区的磷酸化位点

第三节 多克隆抗体特异性识别神经元中Kv1.4 的T1 区的Se1229

第四节 兴奋性神经递质谷氨酸受体NMDA 介导KV1.4 的Se1229 的磷酸化

第五节 神经回路递质传递激活突触后Kv1.4 的Se1229 磷酸化

第六节 PKA 特异性介导神经回路递质传递激活的突触后Kv1.4 的Se1229 磷酸化

第四章 研究结果分析与结论

第一节 神经元内KV1.4 的Se1229 被PKA 特异性磷酸化

第二节 神经回路活动引起的神经递质传递通过NMDA 受体进钙激活神经元Kv1.4 的Ser229 磷酸化

第三节 神经递质传递激活的PKA 磷酸化Kv1.4 的Se1229

第四节 结论

第五章 问题、思考和讨论

参考文献

发表文章目录

综述NF-κB 在中枢神经系统神经元凋亡中的作用

致谢

发布时间: 2005-09-09

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