磁性靶向治疗动脉粥样硬化不稳定斑块的DNA/阳离子脂质体复合物的研究

论文摘要

动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）性疾病是严重危害人类健康的一大类疾病,致死、致残率高。目前对动脉粥样硬化仍无好的治疗方法,主要是通过识别动脉粥样硬化不稳定斑块（unstable plaque）并及早临床干预,增强斑块的稳定性。而基因治疗（Gene therapy）是稳定动脉粥样硬化不稳定斑块很有前途的一种治疗方法。近年来的研究表明,载脂蛋白（Apo—AI）和B族Ⅰ型清道夫受体（SR—BI）的表达对动脉粥样硬化均具有保护作用,其过度表达均能明显减少动脉粥样硬化的发生。基于此,本研究将APO-AI和SR-BI基因作为治疗动脉粥样硬化不稳定斑块的治疗基因。目前基因治疗载体可分两大类:病毒载体和非病毒载体。阳离子脂质体（cationic liposomea,CL）是目前用于基因治疗的研究最广泛的非病毒类载体之一,具有毒性低、转移的核苷酸大小范围广（从寡核苷酸到人工染色体均可）、制备方法较简单等优点。但是该载体仍存在转染效率较低、靶向性差等问题。因此,提高CL的靶向性是当前基因载体研究的重要发展方向之一。为提高CL的靶向性,本研究将磁靶向给药系统的原理引入CL介导的基因转染中,即制备磁性阳离子脂质体（Magnetic cationic liposomes,MCL）。通过在脂质体中掺入一定数量、一定粒径的磁性纳米粒子,利用体外磁场的效应可以引导MCL/DNA复合物在体内定向移动和定位集中,从而达到在靶组织目的基因高效靶向表达的效果。本研究制备得到磁性阳离子脂质体/DNA复合物,通过体外细胞实验及大鼠体内靶向性实验验证了其用于提高阳离子脂质体转染的靶向性从而提高转染效率的可行性,还通过大鼠体内的初步药效学实验验证其用于磁性靶向治疗动脉粥样硬化不稳定斑块的可行性。本研究将大鼠Apo—AI、SR—BI基因以及虫荧光素酶（luciferase）报告基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（+）中,分别构建重组成pcDNA3.1（+）/APO-AI、pcDNA3.1（+）/SR-BI和pcDNA-CMV luciferase表达质粒。由此构建成的表达载体可以在哺乳动物细胞中高效表达。还通过酶解和测序鉴定了三种质粒的准确性。本研究建立了邻菲哕啉法测定铁含量,以吸收度A为纵坐标,以浓度C（μg/mL）为横坐标进行线性回归,得到直线方程为:A=0.0198C-0.0072,r=0.9999。结果表明,浓度在5—30μg/mL的范围内线性关系良好。低、中、高浓度下的回收率、精密度均符合方法学要求。本研究以二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）以及3β-[N-（N′,N′-二甲氨基乙基）]氨甲酰基-胆固醇（DC-Chol）为脂质体的脂质成分,并采用逆相蒸发法制备磁性阳离子脂质体（MCL）。通过单因素考察确定MCL的制备条件为:有机溶剂选择体积比1:9的氯仿/乙醚混合溶剂;油水相体积比4:1;pH为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）作分散介质;α-生育酚用量为磷脂质量的1%;采用辐射灭菌法对脂质体除菌。本研究采用紫外分光光度法建立了质粒DNA含量测定方法,以紫外吸收强度A为纵坐标,以浓度C（μg/mL）为横坐标进行线性回归,得到直线方程为:A=0.0207C+0.0009,r=0.9999。结果表明,浓度在1.25—20μg/mL的范围内线性关系良好。采用低温高速离心法测定DNA包封率,回收率实验符合要求。对复合物进行琼脂糖凝胶电泳考察形成稳定复合物所需的最低DC-Chol/DNA质量比值为2。考察了DC-Chol/DNA质量比对MCL/DNA复合物的粒径、zeta电位以及DNA包封率的影响,实验结果表明DC-Chol/DNA质量比值大于等于9时制得的复合物结构较稳定,DNA包入囊泡中可有效被保护从而保证较高的转染效率,因此本研究优选了DC-Chol/DNA质量比为9的复合物,用于后面的动物实验部分。并对优化后的MCL/DNA复合物进行了相关性质的考察:用透射电子显微镜观察复合物的形态并对其进行能谱分析,结果表明制得的复合物内含有磁性物质及DNA;用纳米粒度及电位分析仪测得复合物的粒径为343.4nm,多分散系数0.231,符合预期要求,复合物的zeta电位为+37.5mV,体系稳定性较好;复合物中DNA的包封率为79.5%;体外磁场响应性能考察则表明复合物保留了磁性脂质体的良好的磁场相应性能。本研究采用MTT法测定不同的铁含量的MCL以及CL对人正常肝细胞（THLE-3）的毒性,结果表明铁含量为80μg/mL的MCL对细胞的毒性与CL相似,均不大,细胞存活率均在80%以上。结果还表明当DC-Chol/DNA的质量比≥15时各组制剂均表现出一定的细胞毒性,且当铁含量达到176.5μg/mL时,细胞毒性作用较80μg/mL组有明显增大（P＜0.05）。由于细胞的转染与细胞的状态有较大关系,因此本实验选择铁含量为131.6μg/mL和80μg/mL的MCL进行进一步的细胞转染实验,且各组制剂的DC-Chol/DNA的质量比均选择在≤10。本研究用重新构建的pcDNA-CMV luciferase质粒作报告基因,优化了MCL与CL在THLE-3中的转染条件并比较了在最优转染条件下MCL（加外加磁场与自然条件下）与CL的转染效率。MCL的最优转染条件为DC-Chol/DNA质量比为5,MCL/DNA复合物与细胞的作用时间为8h,外加磁场的作用时间为30min。CL的最优转染条件为DC-Chol/DNA质量比为2.5,CL/DNA复合物与细胞的作用时间为8h。最优转染条件下,自然条件下的MCL的转染效率与CL无差别,但是在外加磁场的作用下,MCL在THLE-3细胞中转染效率较CL提高了2.6倍（P＜0.01）。本研究对MCL/DNA复合物在大鼠体内的靶向性进行了初步研究。大鼠尾静脉注射MCL/DNA复合物,在其肝部固定钕铁硼永磁铁进行磁场导向,24h后测定报告基因在心、肝、脾、肺、肾中的表达情况。其中,在肝脏中的表达结果表明,MCL/DNA复合物有外加磁场诱导下（+）的荧光素酶的表达分别为自然条件下（一）及CL/DNA复合物的1.5倍（P＜0.01）和2.7倍（P＜0.01）。本研究以APO-AI和SR-BI作为治疗基因,MCL为基因载体并加以磁场导向,对大鼠动脉粥样硬化模型进行基因治疗的初步研究。血脂测定结果表明,与对照组比较,可见6周后各基因治疗组的血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）明显下降（P＜0.01）,高密度脂蛋白（HDL）明显升高（P＜0.01）。病理学大体标本的观察结果显示各基因治疗组动脉粥样硬化斑块减小,部分血管管壁变柔软,弹性恢复,管腔内膜变光滑,血管管壁增厚不明显。经油红O染色的病理学观察显示:血管内膜表面不规则的红色隆起减少,基因治疗组一脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为9.21%和1.16%,组二分别为9.20%和1.18%。镜下观察结果显示内皮细胞增生减弱,纤维膜下可见少量泡沫细胞聚集。对照组血管管壁仍明显僵硬增厚,血管内膜表面多发不规则的红色隆起,脂质条纹面积和纤维斑块面积的百分比分别为32.25%和1.66%。镜下显示内皮细胞增生明显,纤维膜下可见大量泡沫细胞聚集,斑块突向管腔,呈典型的脆性斑块表现。以上血脂测定结果以及病理结果均可说明MCL/DNA复合物用于靶向基因治疗有效,SR-BI、Apo-A-I基因在靶向作用下可以定向到达肝脏,可以升高高密度脂蛋白水平,阻止动脉粥样硬化的发展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 质粒的构建与扩增
• 一、仪器与材料
• （一） 菌株及细胞
• （二） 主要试剂
• （三） 主要仪器
• 二、实验方法
• （一） 菌种的复苏与冻存
• （二） 感受态细菌的制备
• （三） 重组质粒的转化
• （四） 质粒DNA的小量抽提
• （五） pcDNA-CMV luciferase真核表达载体的构建
• （六） 重组表达质粒pcDNA3.1（+）/SR-BI和pcDNA3.1（+）/APO-AI的构建
• （七） 质粒DNA的大量抽提和纯化
• 三、实验结果
• （一） pcDNA-CMV luciferase真核表达载体的构建与鉴定
• （二） 重组表达质粒pcDNA3.1（+）/SR-BI和pcDNA3.1（+）/APO-AI的构建
• 四、小结与讨论
• （一） 基因治疗的质粒载体的要求
• （二） 重组表达载体pcDNA3.1（+）/SR-BI和pcDNA3.1（+）/APO-AI的构建策略
• （三） 用于动脉粥样硬化不稳定斑块基因治疗的基因的选择
• 第二章 磁性阳离子脂质体/DNA复合物的制剂学研究
• 一、仪器与材料
• （一） 主要试剂
• （二） 主要仪器
• 二、方法与结果
• （一） 磁性阳离子脂质体的制备
• （二） MCL/DNA复合物的制备
• （三） 质粒DNA含量测定及包封率测定方法的建立
• （四） MCL与pDNA质量比的确定
• （五） 优化条件下的MCL/DNA复合物体外相关性质的考察
• 三、讨论
• （一） 铁含量的测定方法
• （二） MCL的制备
• （三） MCL与pDNA质量比的确定
• 四、小结
• 第三章 磁性阳离子脂质体/DNA复合物的体外细胞学实验
• 一、仪器与材料
• （一） 细胞株与质粒
• （二） 主要试剂与试剂盒
• （三） 主要仪器
• 二、实验方法
• （一） 细胞复苏
• （二） 细胞传代
• （三） 细胞毒性实验
• （四） 细胞转染实验
• （五） 报告基因的表达检测
• 三、实验结果与讨论
• （一） THLE-3人正常肝细胞显微镜下照片
• （二） 细胞毒性实验
• （三） 细胞转染实验
• 四、小结
• 第四章 磁性阳离子脂质体/DNA复合物在大鼠体内的靶向性及药效学初步研究
• 一、仪器与材料
• （一） 主要试剂
• （二） 仪器
• 二、实验方法
• （一） MCL/DNA复合物在大鼠体内的靶向性初步研究
• （二） MCL/DNA复合物用于大鼠动脉粥样硬化基因治疗的药效学初步研究
• 三、结果与讨论
• （一） 报告基因在大鼠体内各器官的表达情况
• （二） MCL/DNA复合物用于大鼠动脉粥样硬化基因治疗的药效学初步研究
• 四、小结
• 全文总结
• 综述 阳性脂质体介导基因转染及其研究进展
• 参考文献
• 在读期间发表论文和申请专利情况
• 致谢