论文摘要
目的:预测、筛选肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）III型分泌系统（Type III secretion system,T3SS）效应蛋白编码基因,并研究其免疫活性,探讨预测的T3SS效应蛋白重组蛋白在临床Cpn血清学诊断中的应用价值。方法:①通过生物信息学分析结合相关文献报道,预测Cpn T3SS效应蛋白编码基因;②以Cpn AR39菌株总RNA为模板,RT-PCR从转录水平分析Cpn T3SS效应蛋白编码基因在感染细胞的表达情况,并筛选出在感染后72小时有表达的基因;③PCR扩增预测Cpn T3SS效应蛋白编码基因,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-2中构建重组质粒pGEX-6P-2/目的片段,经PCR、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;对温度、IPTG和时间等诱导表达条件进行系列的优化后,获得可溶性表达蛋白并大量诱导表达。GST纯化树脂纯化重组蛋白,用tris8.0将目的蛋白透析降低谷胱甘肽浓度,BCA法测定蛋白浓度;用重组蛋白包被微孔板,建立间接ELISA法检测临床Cpn患者血清,评价重组蛋白的抗原性;用重组蛋白经皮下注入免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠血清中重组蛋白多克隆抗体的效价,分析重组蛋白的免疫原性,并以制备的多克隆抗体为一抗,应用间接免疫荧光检测预测蛋白在感染细胞的定位情况,以筛选Cpn分泌性蛋白。结果:通过生物信息学分析结合相关文献报道,预测了14个Cpn T3SS效应蛋白编码基因:Cpn0704,Cpn0710,Cpn1022,Cpn0810,Cpn0962,Cpn0960,Cpn0422,Cpn0425,Cpn0323,Cpn0322,Cpn0432,Cpn0431,Cpn0434,Cpn0661。RT-PCR分析筛选了11个在感染后72h有表达的基因: Cpn0704,Cpn0710,Cpn1022,Cpn0810,Cpn0962,Cpn0960,Cpn0422,Cpn0425,Cpn0323,Cpn0322,Cpn0431;PCR扩增得到其目的片段;构建的重组质粒经PCR和测序鉴定证实插入片段为目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致;SDS-PAGE结果显示,在IPTG诱导下,重组工程菌分别表达了相对分子量（Mr）与预测分子量相近的蛋白,对诱导表达条件进行系列的优化后,获得5个可溶性表达蛋白:Cpn1022,Cpn0960,Cpn0810,Cpn0704,Cpn0425,经GST纯化树脂纯化后,纯度在98%以上;以纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,检测临床Cpn患者血清,我们收集了20例确诊为Cpn感染患者血清和10例正常人的血清进行ELISA分析,结果显示:Cpn0810能识别全部病人的血清,Cpn0425能识别17个病人的血清,Cpn0960与Cpn0704能与14个病人的血清发生反应,Cpn1022只识别11个病人的血清,而正常人的血清未出现上述反应。利用纯化的Cpn1022,Cpn0960,Cpn0810,Cpn0704,Cpn0425重组蛋白免疫新BALB/c小鼠,间接ELISA法测定兔免疫血清特异性抗体,效价分别为Cpn0810与Cpn0425达1:64000,Cpn0960与Cpn0704达1:32000,Cpn1022达1:16000;5种重组蛋白刺激BALB/c小鼠,皮肤出现发热、红肿,610d后逐渐消失,迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity,DTH）阳性。结论:1. Cpn0704,Cpn0710,Cpn1022,Cpn0810,Cpn0962,Cpn0960,Cpn0422,Cpn0425,Cpn0323,Cpn0322,Cpn0431在Cpn感染细胞后72h有转录;2.成功构建pGEX-6P-2/Cpn0704,Cpn0710,Cpn1022,Cpn0810,Cpn0962,Cpn0960,Cpn0422,Cpn0425,Cpn0323,Cpn0322,Cpn0431等11个原核表达载体,将其转化至E.coli BL21后表达出相应的重组蛋白;3. Cpn1022,Cpn0960,Cpn0810,Cpn0704,Cpn0425重组蛋白具有良好的免疫原性,能刺激BALB/c小鼠产生高效价的特异性抗体;4. Cpn1022,Cpn0960,Cpn0810,Cpn0704,Cpn0425重组蛋白具有较好的抗原性,能与Cpn阳性血清特异性结合。
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