小麦耐盐相关基因HKT克隆及多样性与功能研究

论文摘要

土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性问题,在世界范围内引起多种作物减产。小麦（Triticum aestivum L.）作为世界重要粮食作物,与其他作物一样,土壤盐渍化严重制约着小麦的生产。运用分子生物学技术和手段研究小麦耐盐基因,不仅有助于小麦耐盐机制的研究,而且有助于耐盐小麦的培育。盐渍化土壤中Na+和Cl-是抑制植物生长的主要因素。但对大多数植物来说,Na+是植物离子特异性损害的最主要原因。因此,克隆与小麦Na+吸收有关的基因,分析这些基因在小麦中的自然变异,不仅可以了解这类基因在小麦耐盐机制中的作用,而且有助于通过传统育种或遗传工程技术提高小麦的耐盐性。 根据小麦TaHKT1（high-affinity potassium uptake transporter）cDNA核苷酸序列设计引物,从普通小麦中国春中分别克隆出TaHKT1的基因组序列和cDNA序列,通过二者的比较,确定了TaHKT1的基因结构。TaHKT1含有3个外显子和2个内含子。在38份普通小麦材料中发现5种类型TaHKT1,分别命名为TaHKT1-1、TaHKT1-2、TaHKT1-3、TaHKT1-4和TaHKT1-5。根据TaHKT1基因组序列,从不同小麦材料中分别克隆了TaHKT1-1、TaHKT1-2、TaHKT1-3和TaHKT1-4相应的cDNA序列,但未发现TaHKT1-5相应的cDNA,并且根据结构预测TaHKT1-5在N195存在1个终止密码子,因此推测TaHKT1-5可能为假基因。在小麦野生近缘种中克隆了19种TaHKT1,其核苷酸序列多样性高于普通小麦。小麦野生近缘种、地方品种和育成品种TaHKT1多样性分析表明,TaHKT1属于驯化基因。 根据小麦TaHKT1cDNA序列设计引物筛选粗山羊草（Aegilops tauschii）AL8/78 BAC文库和矮败中国春小麦BAC文库,通过单克隆BAC质粒延伸测序克隆了TaHKT2、TaHKT3以及TaHKT1、TaHKT2和TaHKT3的侧翼序列。在13份普通小麦材料中分别克隆了2种类型TaHKT2和3种类型TaHKT3,分别命名为TaHKT2-1、TaHKT2-2、TaHKT3-1、TaHKT3-2和TaHKT3-3。TaHKT2 5’-非翻译区2个碱基的缺失可能是导致该基因沉默的原因。在普通小麦莱州953中克隆了TaHKT4及其侧翼序列,在13份普通小麦材料中克隆了5种类型TaHKT4,分别命名为TaHKT4-1、TaHKT4-2、TaHKT4-3、TaHKT4-4和TaHKT4-5。根据TaHKT2、TaHKT3和TaHKT4 5’侧翼序列设计基因特异引物,以中国春缺四体DNA为模板,将TaHKT2、TaHKT3和TaHKT4分别定位于染色体7D、7B和7A。 根据水稻SKCI（Shoot K+ Content）对应的小麦EST序列设计引物,筛选粗山羊草AL8/78 BAC文库,测序获得粗山羊草AL8/78 AeSKC1,进一步克隆了普通小麦中国春TaSKC1。在27份普通小麦材料中仅发现TaSKC1-1和TaSKC1-2 2种类型TaSKC1,二者仅在第一内含子存在1个碱基的转换。在14份地方品种和13份育成品种中发现均仅含有TaSKC1-1和TaSKC1-2。从8份小麦合成双二倍体（染色体组为ABD）中克隆了5种TaSKC1,其中3种与普通小麦TaSKC1不同。小麦合成双二倍体、地方品种和育成品种TaSKC1的多态性研究表明,TaSKC1在驯化过程中存在明显的瓶颈效应,属于驯化基因。根据小麦TaSKC1设计引物筛选矮败中国春小麦BAC文库,获得小麦TaSKC2及其侧翼序列,在12份普通小麦材料中发现2种类型TaSKC2,分别命名为

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 盐胁迫对作物的伤害
• 1.2 作物耐盐机理
• 1.2.1 作物拒盐机制
• 1.2.2 作物耐盐机制
• 1.3 作物耐盐遗传
• 1.4 耐盐相关基因的研究进展
• 1.4.1 调控基因
• 1.4.2 离子泵和转运蛋白
• 1.4.3 渗调质合成相关酶类
• 1.4.4 活性氧清除剂
• 1.4.5 LEA相关蛋白
• 1.4.6 其它
• 1.5 盐胁迫信号传导
• 1.6 基于比较基因组学的新基因发掘
• 1.7 单核苷酸多态性的研究进展
• 1.8 本研究的内容、意义和所采取的技术路线
• 1.8.1 研究内容和意义
• 1.8.2 技术路线
• 第二章 普通小麦HKT基因克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 TaHKT1克隆
• 2.2.2 TaHKT阳性BAC克隆筛选
• 2.2.3 TaHKT1侧翼序列克隆
• 2.2.4 AeHKT2克隆
• 2.2.5 TaHKT2克隆
• 2.2.6 TaHKT3克隆
• 2.2.7 TaHKT4克隆
• 2.2.8 粗山羊草AL8／78 AeSKC1克隆
• 2.2.9 TaSKC1克隆
• 2.2.10 TaSKC2克隆
• 2.2.11 TaHKT2、TaHKT3和TaHKT4定位
• 2.2.12 侧翼序列比较分析
• 2.2.13 TaHKT1、TaSKC1与OsSKC1的同源性比较
• 2.2.14 HKT的系统发育
• 2.3 讨论
• 第三章 普通小麦HKT基因多样性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 普通小麦TaHKT1多样性分析
• 3.2.2 普通小麦近缘种中TaHKT1多样性分析
• 3.2.3 普通小麦TaHKT2多样性分析
• 3.2.4 普通小麦TaHKT3多样性分析
• 3.2.5 普通小麦TaHKT4多样性分析
• 3.2.6 普通小麦TaSKC1多样性分析
• 3.2.7 合成双二倍体TaSKC1多样性分析
• 3.2.8 TaSKC2多样性分析
• 3.3 讨论
• 第四章 普通小麦HKT功能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 酵母表达载体构建
• 4.2.2 转基因酵母的质粒PCR检测
• 4.2.3 TaHKT功能分析
• 4.3 讨论
• 第五章 普通小麦HKT1启动子功能研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 HKT1启动子表达载体的构建
• 5.2.2 农杆菌转化
• 10.2.3 转基因拟南芥植株的PCR检测
• 10.2.4 PCR阳性拟南芥植株GUS组织化学分析
• 5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历