pVAX1/SjHGPRT·SDISP和pVAX1/IL-18联合疫苗的抗病免疫保护效果的研究

论文摘要

研究背景血吸虫病在世界范围内广泛流行,严重影响人类健康与社会经济发展。经过60多年的规划防治,我国的血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的巨大成就。目前,仅湖南、湖北、江西、安徽湖区四省尚未达到传播控制标准。湖区血吸虫病的流行,因其有螺面积大、钉螺孳生环境复杂、终宿主种类多、人畜流动频繁等原因,湖区四省部分疫区在达到疫情、传播控制甚至传播阻断标准后,仍出现钉螺面积增加、新发感染的急性病人等状况,湖区血吸虫病防治任务依然繁重。因此,控制传染源为主的措施是我国当前血防工作的重要策略。通过免疫的方法,抑制雌虫生殖产卵、阻止虫卵胚胎发育、减少虫卵对肝肠组织的损害,减少免疫宿主粪卵的排放等,不仅从个体上减轻发病、控制疾病慢性化过程的发展,更重要的是,从源头上控制和阻断了血吸虫病的传播。本实验室前期研究已经证实SIEA及其SIEA26/28kDa组分具有抗卵胚发育和抗雌虫生殖产卵的效果,从SIEA26/28kDa组分中筛选了3个抗原免疫反应最强的蛋白分子,其中两个分别与HGPRT、SDISP相关,随后采用不同的载体成功构建并表达了SjHGPRT、SjSDISP,在动物免疫保护效果、安全性等方面进行了大量的研究,证明SjHGPRT、SjSDISP对免疫动物具有较好的抗卵免疫保护效果,而且安全性较好,具有潜在的现场应用价值。研究目的1.构建、表达及鉴定SjHGPRT·SDISP融合蛋白；2、观察pVAX1/IL-18与pVAX1/sjHGPRT·SDISP联合免疫小鼠的抗病效果及对血吸虫性肝纤维化的影响。研究方法1.据sjHGPRT·SDISP基因的开放阅读框架（ORF）设计上下游引物,以pVAX1/sjHGPRT·SDISP质粒为模板,构建pET32a/sjHGPRT·SDISP, PCR、双酶切和DNA测序证实构建成功后,进行蛋白表达。2.50只5-6周龄雌性Balb/c鼠随机分组：NS对照组、pVAX1对照组、pVAX1/IL-18免疫组、pVAX1/sjHGPRT·SDISP免疫组、联合免疫组。每只小鼠肌肉注射100μg/100μl相应质粒,其中NS对照组注射100μl NS,联合免疫组采用1/2免疫方案,每只小鼠注射59μg/59μl pVAXl/sjHGPRT·SDISP与50μg/50μl pVAXl/IL-18的质粒混合物。免疫两周后经腹部皮肤感染20±1条日本血吸虫尾蚴。免疫前及免疫后每2周小鼠尾静脉采血100μ1并分离血清。感染56d后剖杀小鼠,收集成虫、虫卵并分别计算减虫率及减卵率。观察肝脏的外观及虫卵结节的数目,肝脏组织切片HE染色及masson染色,测量虫卵肉芽肿直径。检测各免疫组特异性IgG抗体含量及IL-4、 IFN-y的含量。研究结果1.PCR、双酶切及DNA测序结果证实构建质粒中的基因片段与sjHGPRT·SDISP目的基因片段一致,对工程菌进行诱导表达后,在76.3kDa处获得了大量的表达蛋白,且在IPTG浓度为0.2mmol/L,温度为32℃诱导4h时蛋白的表达量最大,western-blot证实表达蛋白与预期蛋白一致。2. pVAX1/SjHGPRT·SDISP免疫组和联合免疫组小鼠的肝减卵率分别为42.03%（15085.67±5683.47）、44.36%（14478.90±8713.76）,肠减卵率分别为77.24%（1516.17±6026.24）、76.81%（15454.46±3299.82）,粪减卵率分别为70.73%（411.20±258.94）、72.21%（390.40±262.35）,与NS组及pVAX1组相比,筹异均有统计学意义（p<0.05）。3.NS对照组及pVAX1对照组小鼠肝脏颜色较深,虫卵结节较多,虫卵肉芽肿较大,其直径分别达到（505.35±111.69）μm、（456.58±68.18）μm,而p VAX1/SjHGPRT·SDISP免疫组和联合免疫组（1/2剂量）小鼠虫卵肉芽肿直径分别为（381.23±76.80）μm、（344.78±99.90）μm; pVAX1/IL-18组、pVAX1/SjHGPRT·SDISP组及联合免疫组（1/2剂量）小鼠肝脏组织切片Masson染色后,彩色病理分析获得MOD,分别为66.85±16..22、46.56±13.84、42.60±10.63,均低于NS组（131.13±38.53）及pVAX1组（103.80±17.78）（p<0.05）;pVAX1/SjHGPRT·SDISP免疫组和联合免疫组（1/2剂量）小鼠均可诱导产生大量特异性IgG抗体：与NS对照组相比pVAX1/SjHGPRT·SDISP免疫组和联合免疫组小鼠IFN-γ含量明显升高（p<0.05）；IL-4含量各组间没有变化。结论1.成功构建并表达大量SjHGPRT·DISP融合蛋白。2. pVAX1/SjHGPRT·SDISP疫苗与联合免疫组（1/2剂量）均具有较高的免疫保护效果,pVAX1/IL-18可增强pVAX1/SjHGPRT·SDISP疫苗的免疫保护效果。3. pVAX1/SjHGPRT·DISP与pVAX1/IL-18均可抑制肝纤维化的形成,可能机制：通过增强细胞免疫应答,促进机体分泌IFN-γ,诱导Thl型细胞免疫,从而抑制肝纤维化的形成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 前言
• 技术路线
• 第一章 日本血吸虫融合蛋白HGPRT·SDISP的构建、表达及鉴定
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒、菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 pET32a/SjHGPRT·SDISP表达载体的构建
• 1.2.2 阳性克隆的鉴定
• 1.2.3 编码氨基酸序列的预测
• 1.2.4 蛋白表达及其条件的优化
• 1.2.5 融合蛋白表达形式的分析
• 1.2.6 蛋白的纯化及浓度测定
• 1.2.7 Western blot分析
• 1.3 结果
• 1.3.1 SjHGPRT·SDISP的扩增及纯化
• 1.3.2 重组质粒的构建及鉴定
• 1.3.3 氨基酸序列的预测结果
• 1.3.4 蛋白表达的优化条件及其可溶性表达形式
• 1.3.5 纯化蛋白的浓度
• 1.3.6 western-blot活性鉴定结果
• 1.4 讨论
• 1.4.1 抗原分子的选择
• 1.4.2 蛋白表达载体的选择
• 1.4.3 大量表达SjHGPRT·SDISP融合蛋白的意义
• 第二章 pVAX1/SjHGPRT·SDISP和pVAX1/IL-18联合免疫抗日本血吸虫及肝纤维化的效果
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、菌株
• 2.1.2 主要实验试剂及设备
• 2.1.3 实验动物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒的提取
• 2.2.2 SjHGPRT·SDISP融合蛋白的大量提取及纯化
• 2.2.3 Balb/c小鼠免疫保护性的研究
• 2.2.5 统计学处理
• 2.3 结果
• 2.3.1 各实验组的成虫数及减虫率
• 2.3.2 各实验组的虫卵定量计数结果
• 2.3.3 抗肝纤维化免疫的保护效果
• 2.3.4 各时期特异性IgG抗体水平及其动态变化
• 2.3.5 细胞因子1L-4、1FN-γ水平
• 2.4 讨论
• 2.4.1 IL-18作为佐剂对pVAX1/SjHGPRT·SDISP的免疫增强作用
• 2.4.2 联合免疫对肝纤维化的影响
• 参考文献
• 综述 日本血吸虫DNA疫苗联合免疫的研究进展
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位论文期间的工作