论文摘要
第一部分抗人iASPP单克隆抗体的制备及研究应用实验目的:应用脾脏内注射真核iASPP-SV表达质粒免疫的方法制备抗人iASPP单克隆抗体（McAb）,并对其生物学特性进行初步研究。实验方法:RT-PCR方法克隆iASPP-SV编码区cDNA。将扩增所得到的全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）中,并将iASPP-SV基因全长和基因片段克隆到原核表达载体pET28a中。诱导PIAF和PIAS载体在大肠杆菌Rosseta（DE3）中表达PIAF和PIAS蛋白。通过盐酸胍变性溶解包涵体,并经镍柱纯化得到重组PIAF和PIAS蛋白。采用脾脏内注射真核pcDNA3.1-iASPP-SV（CIAF）免疫Balb/c小鼠3天后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞（NS1）用传统的淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人iASPP单克隆抗体。应用原核表达的iASPP-SV全长及iASPP-SV片段His-tag融合蛋白进行间接ELISA法筛选阳性克隆。并对亚克隆后的阳性杂交瘤细胞株所制备的抗体的生物学功能进行了初步鉴定。实验结果:我们利用RT-PCR方法从人白血病细胞系U-937中克隆出癌基因iASPP-SV编码cDNA,成功构建iASPP-SV表达载体PIAF、PIAS和CIAF,重组质粒读码框和序列与预期一致。在IPTG诱导下,重组载体大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株,表达产物经SDS-PAGE和western blot方法分析证实系PIAS和PIAF融合蛋白。利用Ni2+鳌合层析的方法纯化PIAS和PIAF融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定其纯度超过80%。用CIAF质粒通过脾脏内注射免疫所获得的小鼠脾脏细胞通过细胞融合、筛选和克隆化培养最后得到10株单克隆抗体细胞株。我们所获得的抗体能与天然iASPP-SV和iASPP蛋白及重组iASPP-SV蛋白特异性结合,而且实验表明所获得的抗体可以应用于western blot、免疫组织化学等实验。实验结论:本研究成功地应用脾脏内注射真核iASPP-SV表达质粒免疫制备了针对人iASPP蛋白的抗体,该抗体能够特异识别iASPP-SV和iASPP两个异构体。为进一步对iASPP蛋白水平检测以及其功能、作用机制等实验研究奠定了良好的工作基础。第二部分iASPP-SV能够与Sp1相互作用并抑制Sp1介导的p21WAF1/CIP1转录研究目的:探讨iASPP-SV与转录因子Sp1相互作用和对Sp1介导的p21WAF1/CIP1启动子转录的影响及其作用机制。研究方法:将FLAG-iASPP-SV与Sp1质粒共转染293和KB细胞系应用免疫共沉淀、免疫荧光方法检测iASPP-SV能否与Sp1相结合及其在细胞核内共定位。应用荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀技术进一步深入研究iASPP-SV对Sp1介导的p21WAF1/CIP1启动子的转录影响及其机制。结果:我们将iASPP-SV与Sp1共转染细胞后发现iASPP-SV能够在细胞内与Sp1相结合,并共定位于细胞核内。iASPP-SV可以抑制含有Sp1 1-6结合位点的pGL3-Basic-p21WAF1/Cip1-promoter以及仅含有Sp1 3-6结合位点的pGL3-Basic-p21WAF1/Cip1-101-promoter荧光素酶报告质粒的转录活性。进一步研究发现iASPP-SV可以结合于p21WAF1/Cip1启动子区的Sp1结合位点。结论:iASPP-SV可以在细胞内结合Sp1并共定位于细胞核;iASPP-SV可以抑制Sp1介导的p21WAF1/Cip1转录;iASPP-SV可以结合于p21WAF1/Cip1启动子区的Sp1结合位点。
论文目录
相关论文文献
- [1].叶酸通过调节p53/p21(waf1/cip1)信号途径促进小鼠神经干细胞增殖和分化[J]. 神经解剖学杂志 2012(03)
- [2].p21~(Waf1/Cip1)甲基化调控细胞衰老[J]. 重庆医学 2015(08)
- [3].白藜芦醇体外对肝癌HepG2细胞分化及P21~(WAF1/CIP1)表达的影响[J]. 中国现代医学杂志 2010(08)
- [4].白藜芦醇体外对肝癌HepG2细胞分化及P21~(WAF1/CIP1)表达的影响[J]. 现代生物医学进展 2009(02)
- [5].下调细胞P21~(WAF1/CIP1)基因表达可抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型复制[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2009(04)
- [6].人P21~(WAF1/CIP1)启动子荧光素酶真核表达载体的构建[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志 2008(02)
- [7].组蛋白去乙酰化酶抑制剂调控p21~(WAF1/CIP1)启动子乙酰化水平影响乳腺癌MCF-7细胞周期[J]. 中国药理学通报 2017(10)
- [8].大鼠放射性肺损伤进程中PAI-1、P21~(WAF1/CIP1)、α-SMA和PCNA表达的变化及意义[J]. 中国体视学与图像分析 2011(04)
- [9].上皮性卵巢癌中P73蛋白、P21~(WAF1/CIP1)蛋白、PCNA蛋白的表达及其相关性[J]. 中国妇幼保健 2010(13)
- [10].姜黄素对血管平滑肌细胞增殖及cyclinD1和p21~(waf1/cip1)蛋白表达的影响[J]. 心脏杂志 2009(03)
- [11].P21~(WAF1/CIP1)和survivin在人脑星形细胞瘤中的表达及其相关性[J]. 广东医学 2009(06)
- [12].乳腺癌MCF-7细胞p21~(WAF1/CIP1)启动子区雌激素受体α的高功能结合位点[J]. 中国医科大学学报 2017(08)
- [13].重组核心蛋白聚糖转染对HepG2细胞p21~(WAF1/CIP1)表达的影响[J]. 吉林大学学报(医学版) 2009(01)
- [14].RNA激活技术上调p21~(WAF1/CIP1)基因表达对胆囊癌细胞增殖、侵袭与迁移能力的影响[J]. 肝胆外科杂志 2012(03)
- [15].乳腺癌MCF-7细胞p21~(WAF1/CIP1)启动子区HDAC1高功能结合位点的研究[J]. 中国药理学通报 2017(03)
- [16].HDAC6、p21~(WAF1/CIP1)和CyclinD1在皮肤鳞状细胞癌中的表达[J]. 中国美容医学 2015(15)
- [17].硒对乳腺癌细胞株p21~(WAF1/CIP1)启动子的调控作用[J]. 现代肿瘤医学 2009(03)
- [18].脑星形细胞瘤CyclinD1、P21~(WAF1/CIP1)和Survivin关系的探讨[J]. 江西医学院学报 2008(06)
- [19].p21~(Waf1/Cip1)蛋白在侧腭突MEE/MES消失过程中的表达及意义[J]. 中国口腔颌面外科杂志 2015(02)
- [20].氯乙烯对大鼠肝细胞P21~(WAF1/CIP1)和P53蛋白表达影响[J]. 中国职业医学 2013(03)
- [21].宁夏汉族人群p21~(WAF1/CIP1)基因codon31多态性与食管癌的关联研究[J]. 中华临床医师杂志(电子版) 2012(17)
- [22].侵袭性垂体腺瘤中p21ras p21~(WAF1/CIP1)的表达及临床意义[J]. 中国药物与临床 2010(01)
- [23].眼睑基底细胞癌组织中p21~(WAF1/CIP1)基因表达的研究[J]. 数理医药学杂志 2008(01)
- [24].HDAC1在调控乳腺癌MCF-7细胞p21~(WAF1/CIP1)转录过程中与ERα的协同作用[J]. 中国药理学通报 2017(09)
- [25].香加皮杠柳苷对MCF-7细胞周期及p21~(WAF1/CIP1)表达的影响[J]. 肿瘤防治研究 2010(08)
- [26].PSA启动子介导的TAT-p21~(WAF1/CIP1)融合蛋白在前列腺癌细胞中的特异表达及活性初探[J]. 中国病理生理杂志 2008(03)
- [27].子宫内膜样腺癌中Id-1、Smad4和p21~(WAF1/CIP1)蛋白及mRNA的表达[J]. 安徽医科大学学报 2010(01)
- [28].水飞蓟宾通过上调P15~(INK4B)和P21~(WAF1/CIP1)活化JNK诱导人胰腺癌细胞G1期阻滞及细胞凋亡[J]. 暨南大学学报(自然科学与医学版) 2015(01)
- [29].Notch1、P21~(WAF1/Cip1)及活化caspase3在肝细胞癌中表达的相关性[J]. 实用预防医学 2010(01)
- [30].p53蛋白三维空间结构改变与甲状腺乳头状瘤p21~(WAF1/CIP1)蛋白定量表达关系的研究[J]. 中华肿瘤防治杂志 2008(08)