论文摘要
原发性肝癌是一种分布范围较广、危害严重的致死性疾病，在全球癌症死亡率中居第3位，在我国为第2位癌症死因。近年来，随着分子生物学、基因组学及蛋白质组学的发展，人们对癌症生物学有了进一步认识，原发性肝癌的研究有了很大进展。传统的肝癌治疗主要以手术、放化疗、生物治疗和中医药治疗为主。20世纪80年代以来，随着抗体技术的进步，特别是单克隆抗体技术的出现，肝癌的导向治疗显示出巨大的应用前景。1980年美国Order首先尝试用131Ⅰ标记的抗体对肝癌进行导向治疗，有效地提高了治疗效果。十几年来国内外学者通过不同亲肝癌载体、抗肝癌细胞毒物质以及多种综合治疗手段的探索，极大地丰富了肝癌导向治疗的研究。但是，抗体在导向治疗中仍然存在着许多问题：分子量大影响药物的组织穿透力，鼠源性抗体的异源性诱导机体产生不良的免疫反应等，不仅对患者的身体造成伤害，而且影响到整个肿瘤治疗的效果。而特异性结合肝癌细胞的短肽，由于其分子量小，有利于降低免疫原性，增加偶联药物的穿透性，用此替代单克隆抗体可以提高肿瘤治疗的效果。另外，利用具有内在化能力的抗体或短肽，在理论上可以进一步提高肿瘤导向治疗的杀伤效果。因为内在化抗体或短肽与药物偶联后组成的免疫毒素或免疫脂质体，不仅可以将药物定向地带至特定的细胞，而且还可以将药物运输至肿瘤细胞内部，提高杀伤效率，降低系统毒性，以更好地发挥药物的药理作用。因此，获得内在化肽具有重要的应用前景。噬菌体肽库技术的发展为寻找亲和力高、特异性强的肿瘤靶向肽提供了一种更为便捷的途径，在此基础之上采用特殊的筛选方法还可以获得能够被靶细胞内吞的噬菌体肽，即内在化肽。目前已经有许多成功得到内在化肽并初步探索其应用的报道。本论文拟利用噬菌体展示肽库技术，筛选到与肝癌细胞BEL-7404具有特异性结合能力并且可以内在化的短肽，并对这些短肽进行了体内、体外的鉴定，从而为其作为导向治疗的载体提供一定的理论依据。本论文主要分成以下几个部分：一、利用噬菌体肽库技术筛选肝癌特异性内在化肽利用NEB公司的噬菌体线性12-肽文库，针对肝癌细胞株BEL-7404，通过3轮内在化筛选方法，得到105个与靶细胞特异性结合并内在化的噬菌体单克隆。同时在每轮筛选的过程中，利用噬菌体效价的测定及时检测和比较每轮筛选得到的噬菌体数目，实验结果说明，通过三轮的内在化筛选，噬菌体量从103增加到105，得到了有效的富集。在对筛选得到的噬菌体进行单克隆化后，随机选取了20个噬菌体单克隆进行测序，并对所得到的DNA序列进行比对和分析。通过测序，20个克隆共得到4种序列，分别是DLNYFTLSSKRE（17／20）、DLNYLTLSSKRE（1／20）、DLNYHARSYKRE（1／20）、NLKLLDSQDWDG（1／20），其中，前3个噬菌体克隆都含有共同序列DLNY和KRE。（括号中所示的是每个克隆的出现频率）二、噬菌体内在化肽体内外活性鉴定1．体外活性鉴定利用细胞ELISA的方法，对4种噬菌体克隆的特异性结合能力进行鉴定。通过OD值比较，相比野生型噬菌体M13，四种克隆都与肝癌细胞有明显的亲和作用（p＜0.05）。从免疫荧光直接观察的结果来看，4个噬菌体克隆可以内在化进入肝癌细胞BEL-7404和BEL-7402细胞中，而不能进入对照正常肝细胞HL-7702和正常人胚肾细胞HEK-293中；同时，内在化抑制剂的加入明显抑制了噬菌体肽的内在化，进一步说明了其内在化能力；此外，随着温育时间的增加，LJ01进入肝癌细胞BEL-7404中的数量随之增多。流式细胞术定量鉴定的结果表明，相比较野生型噬菌体，4个克隆都可以内在化进入肝癌细胞中，并且不同细胞内荧光比较结果显示，肝癌细胞BEL-7404、BEL-7402内的绿色荧光强度明显的强于对照的HL-7702细胞。利用Western Blotting技术，我们发现噬菌体克隆LJ01仅与肝癌细胞表面某种分子量约为32.3kd的膜蛋白发生特异性结合，而不能与正常肝细胞中的蛋白发生结合。2．体内活性鉴定我们选择噬菌体单克隆LJ01进行体内回输实验，对其在体内各组织的分布情况进行鉴定，通过噬菌体效价测定，噬菌体在肿瘤组织中的富集率是其他正常组织的3倍以上。免疫组化结果显示，肿瘤组织内可见棕色着色，判断是噬菌体肽富集的结果。三、化学合成内在化肽体内外活性鉴定1．体外活性鉴定将荧光素FAM标记的多肽LJ01直接与人肝癌细胞株BEL-7404、BEL-7402、人正常肝细胞株HL-7702、非小细胞肺癌细胞株NCI-H1299、A549，小细胞肺癌细胞株NCI-H446，舌鳞癌细胞株TCA8113，高转移卵巢浆液性囊腺癌细胞株HO8910PM共8种肿瘤细胞和正常细胞温育后观察，FAM-LJ01可以内在化进入肝癌细胞BEL-7404和BEL-7402细胞内，NCI-H1299细胞中￥的微弱绿色荧光表明LJ01也可以进入这株非小细胞癌细胞株内，而正常细胞HL-7702以及其他肿瘤细胞内未见着色。流式细胞结果表明，BEL-7404和BEL-7402细胞内的平均荧光强度要高于HL-7702细胞。2．体内活性鉴定将FAM-LJ01通过尾静脉注射的方式打入荷瘤裸鼠体内，循环后取组织，切片，荧光显微镜观察可见，FAM-LJ01可以很好的富集在肿瘤组织中，在正常肝组织中仅见微弱的绿色荧光，而在其他组织却少见荧光。从上面的实验结果我们可以得到以下结论：1．本研究成功地从噬菌体随机12-肽文库中筛选到了4个在体内、外均具有特异性靶向并内在化能力的噬菌体克隆；2．具有特异性内在化能力的噬菌体展示肽的同源性序列为DLNYFTLSSKRE（17／20）、DLNYLTLSSKRE（1／20）、DLNYHARSYKRE（1／20）、NLKLLDSQDWDG（1／20），其中，前三个都含有共同序列DLNY和KRE；3．一系列的体内外鉴定结果表明，4个噬菌体肽都有很好的特异性结合能力和内在化能力；4．对化学合成并标记荧光素的多肽FAM-LJ01的体内外鉴定结果表明，游离的多肽LJ01依然保持了良好的特异性结合能力和内在化能力。
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