RTN3/HAP与几种蛋白的相互作用及其功能研究

论文摘要

asy是本实验室发现的一个内质网定位的凋亡诱发基因,hap（homologue of ASY protein）是从人胚肺cDNA文库中克隆的ASY结合蛋白基因（Li et al,2001;Qi et al,2003）,当时称这一基因为asyip（ ASY interacting protein）。序列分析表明HAP和ASY都属于RTN家族,HAP为RTN3,ASY为RTN4B,也称为NogoB。多年以来,本室已对hap基因的转录调控,HAP蛋白的结构、同源异源聚合作用、凋亡诱发功能和内质网应激等进行了大量的研究,为了进一步研究RTN3/HAP参与的细胞凋亡信号转导途径及网络调控,本论文着重分析了RTN3与几种蛋白的相互作用及其功能,阐述了RTN3参与的多种凋亡信号转导途径和各个途径之间的交叉,也初步论述了RTN3与一个AVSD（ Atrioventricular septal defects）风险致病基因产物的作用及对细胞的增殖和凋亡的影响,初步揭示了RTN3与AVSD之间的分子机制。本室的刘青珍博士曾用酵母双杂交系统筛选出果蝇的FADD（dFADD）能与人的RTN3（hRTN3）相互作用。为了进一步证实人的FADD与RTN3的作用,首先我们构建了二者的真核表达载体,运用免疫共沉淀的方法研究它们的相互作用,结果证实二者在哺乳动物细胞内是可以结合的。内源性的FADD能与内源性的RTN3或过表达的RTN3发生相互作用;而对RTN3和FADD相互作用功能区的鉴定实验说明:RTN3的C-端45个氨基酸和FADD的DD区是二者的结合区,这两个区域的缺失将使两种蛋白不能结合;当内质网定位的RTN3过表达时,FADD被招募到内质网上形成复合物,随后激活了caspase-8,Bid被切割为t-Bid,使Cyto c从线粒体释放出来;激光共聚焦实验证明FADD与RTN3在内质网上存在明显的共定位;衣霉素（tunicamycin,TM）刺激下,内源性的FADD被招募到内质网上与RTN3形成复合物,使FADD在内质网上的分布增多,RTN3与FADD的相互作用能影响TM诱发的细胞凋亡和caspase-8的活化。许多的研究表明,FADD在多种死亡受体介导的凋亡信号转导通路中起着重要的作用,Bid是线粒体凋亡途径的重要因子,我们以前证明,过表达的RTN3将引起内质网应激,内质网Ca2+排空,激活caspase-12,内质网定位的RTN3在内质网凋亡信号途径中十分重要,结合本研究结果,我们认为:以RTN3过表达为中心,细胞凋亡的死亡受体信号途径、线粒体信号途径和内质网途径在此发生了对话,形成细胞凋亡途径的信号网络。与此同时我们还发现NogoB也能与FADD作用,而引起FADD途径相关的Cyto c的释放。另外,在本室研究基础上,本文对RTN3与Bcl-2的相互作用和蛋白定位进行了深入的研究。一直以来,Bcl-2被认为是一个主要在线粒体上起作用的重要的凋亡抑制蛋白,它能与Bcl-2家族中的多种蛋白在线粒体上相互作用。本研究发现RTN3作为一个主要定位在内质网且不属于Bcl-2家族成员的蛋白,不仅能在体外和Bcl-2互相结合,而且,提取细胞的亚细胞组分用于免疫共沉淀实验,结果表明:在哺乳动物细胞中RTN3与Bcl-2结合在内质网上。转染外源的Bcl-2和RTN3到HeLa细胞,流式检测发现,RTN3的过表达会导致细胞凋亡,Bcl-2能抑制由外源的过表达RTN3诱发的细胞凋亡。为了更好的研究二者的相互作用,我们用G418筛选得到了稳定表达Bcl-2的HeLa细胞株（BH4）,在BH4中,无论是瞬时转染RTN3导致的蛋白表达增加,还是衣霉素刺激引起的RTN3表达的上调都能促进Bcl-2的凋亡抑制活性,并且使细胞的凋亡率降低。Bcl-2参与的线粒体凋亡途径与RTN3介导的内质网凋亡途径因为这两种蛋白的相互作用而发生了交联。内质网定位的RTN3通常被认为是一个诱导细胞凋亡的蛋白,我们对它除凋亡以外的生理功能知之甚少。鉴于RTN3在很多组织中的高表达,我们很难想象在没有外界或自身信号刺激的情况下,高表达的RTN3会诱导细胞凋亡。本研究发现在AVSD中起着重要作用的细胞黏附分子――CRELD1 （cysteine rich with EGF like domains 1）作为AVSD2的首个散发性致病风险基因的产物,pull-down实验表明它能在体外和RTN3结合;而细胞免疫共沉淀实验也证明,在CRELD1过表达的情况下,CRELD1能与过表达或内源的RTN3在细胞质膜上发生相互作用,二者的作用改变了RTN3的内质网定位,流式细胞仪检测到细胞表面的RTN3蛋白增多;激光共聚焦结果显示CRELD1与RTN3在细胞质膜上有共定位,二者的结合使RTN3较集中的分布在细胞质膜上;MTT实验发现CRELD1与RTN3的相互作用影响了细胞的生长增殖,RTN3过表达是抑制细胞生长的,而CRELD1的外源性过表达减弱了RTN3对细胞生长的这种抑制;对于过表达RTN3诱发的凋亡,CRELD1与RTN3的作用较大的抑制了细胞凋亡,而衣霉素的刺激能减弱二者的相互作用,使凋亡细胞增多。我们以前的结果证明RTN3的凋亡诱发功能依赖于它的内质网定位,本文的结果表明当RTN3被CRELD1拉离内质网时,细胞的凋亡减弱了,可见RTN3的内质网定位对其凋亡功能的发挥是至关重要的,增加它在内质网的定位会加剧细胞凋亡,而减少它在内质网的分布能部分抑制由RTN3过表达而引起的细胞凋亡。这些结果不仅使我们能更好的了解RTN3,而且为AVSD疾病的分子机制研究提供了较好的线索。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 相关研究进展
• 1.1 细胞凋亡（CELL APOPTOSIS）
• 1.1.1 细胞凋亡概述
• 1.1.2 细胞凋亡的病理学意义
• 1.1.3 细胞凋亡信号转导途径
• 1.1.4 细胞凋亡的网络调控
• 1.2 AVSD 疾病与 CRELD1 基因
• 1.2.1 AVSD 的分子遗传学概述
• 1.2.2 AVSD 的致病风险基因
• 1.2.3 AVSD 的发病候选基因
• 1.2.4 AVSD 的其他相关基因
• 1.3 RETICULON（RTN）家族
• 1.3.1 RTN 基因家族的发现及其主要成员
• 1.3.2 RTN 的细胞定位和拓扑构象
• 1.3.3 RTN 家族成员的相互作用蛋白
• 1.3.4 RTN 的功能
• 1.4 本研究的背景
• 1.4.1 本研究室有关RTN3/HAP 的重要研究成果
• 1.4.2 本研究的目的和意义
• 第二章 基本实验技术与方法
• 2.1 质粒 DNA 的制备和纯化
• 2.1.1 质粒 DNA 的小量制备
• 2.1.2 质粒DNA 的大量制备
• 2.1.3 质粒DNA 的纯化
• 2.2. 限制性酶消化
• 2.3. DNA 片段回收
• 2.3.1 低熔点琼脂糖凝胶法
• 2.3.2 玻璃奶（Glass-milk）法
• 2.4. DNA 片段和载体的连接
• 2.5. 感受态细胞的制备
• 2.5.1 冷氯化钙法制备新鲜感受态细胞
• 2.5.2 电转化感受态细胞的制备
• 2.6. 质粒DNA 的转化
• 2.6.1 常规转化法
• 2.6.2 质粒的快速转化法
• 2.6.3 质粒的电转化法
• 2.7 菌种的保存
• 2.8 菌落PCR
• 2.9 PCR 定点诱变（根据 STRATAGENE 的 QUICKCHANGE SITE-DIRECTED MUTAGENESIS KIT 说明，略有改动）
• 2.10 细胞培养基的配制（以RPMI 1640 为例）
• 2.11. 细胞传代培养
• 2.12 细胞的冻存与复苏
• 2.12.1 冻存
• 2.12.2 复苏
• 2.13 细胞转染
• 2.13.1 脂质体转染
• 2.13.2 电转染法
• 2.14 用原核表达系统表达蛋白
• ++ 亲和层析法纯化蛋白质'>2.15 NI⁺⁺亲和层析法纯化蛋白质
• 2.16 抗体的制备
• 2.17 GST 树脂 PULL-DOWN 分析
• 2.18 免疫共沉淀
• 2.19 WESTERN BLOT
• 第三章 RTN3 与FADD 的相互作用及其细胞凋亡信号转导途径
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 质粒、细胞与试剂
• 3.2.2 细胞培养和转染（见第二章）
• 3.2.3 免疫共沉淀
• 3.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡
• 3.2.5 激光共聚焦
• 3.3 结果
• 3.3.1 过表达的 RTN3 与过表达的 FADD 在体内的相互作用
• 3.3.2 过表达的 RTN3 与内源性 FADD 在细胞内的相互作用
• 3.3.3 FADD 与RTN3 相互作用功能区的鉴定
• 3.3.4 RTN3 的C-端45 个氨基酸是与 FADD 结合的功能区
• 3.3.5 过表达的 RTN3 能招募内源性的 FADD 到内质网上形成复合物
• 3.3.6 过表达的RTN3 发动了FADD 依赖型的caspase-8 下游级联事件
• 3.3.7 过表达 RTN3 诱发的caspase-9 下游级联事件是部分 FADD 依赖性的
• 3.3.8 过表达 NogoB 也能以 RTN3 类似方式与 FADD 作用
• 3.3.9 衣霉素刺激下内源性 RTN3 与 FADD 的相互作用及定位
• 3.3.10 FADD 与RTN3 的作用能影响TM 诱发的细胞凋亡和caspase8 活化
• 3.4 讨论
• 第四章 RTN3 与BCL-2 的相互作用以及对细胞凋亡的调控
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 细胞、质粒与试剂
• 4.2.2 细胞培养和转染（见第二章）
• 4.2.3 稳定表达细胞系的构建
• 4.2.4 亚细胞组分的制备
• 4.2.5 免疫共沉淀
• 4.2.6 Pull－Down 实验
• 4.2.7 流式细胞术技术
• 4.2.8 激光共聚焦
• 4.3 结果
• 4.3.1 RTN3 与Bcl-2 在体外的相互结合
• 4.3.2 过表达的 RTN3 与内源性的 Bcl-2 能在细胞内质网上相互结合..
• 4.3.3 外源性 Bcl-2 和 RTN3 表达的消长对细胞凋亡的调控
• 4.3.4 外源刺激对 RTN3 表达的上调促进了 Bcl-2 的富聚与凋亡抑制功能
• 4.4 讨论
• 第五章 RTN3 与一种心脏病致病风险基因产物的结合及其对细胞生理的影响
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 质粒与试剂
• 5.2.2 Pull－down 实验
• 5.2.3 流式细胞技术
• 5.2.4 MTT 法检测细胞生长
• 5.2.5 细胞培养和转染（见第二章）
• 5.2.6 稳定表达细胞系的构建
• 5.2.7 免疫共沉淀和免疫印迹
• 5.2.8 激光共聚焦
• 5.2.9 亚细胞组分的制备
• 5.3 结果
• 5.3.1 RTN3 与 CRELD1 的体外相互作用
• 5.3.2 过表达的CRELD1 与过表达或内源的RTN3 的体内相互作用
• 5.3.3 过表达的 CRELD1 招募内源的 RTN3 到细胞质膜上
• 5.3.4 过表达的 CRELD1 与 RTN3 对细胞生长/死亡的影响
• 5.3.5 过表达 CRELD1 对过表达 RTN3 诱发的细胞凋亡的影响
• 5.4 讨论
• 第六章 超表达 RTN3 对细胞凋亡三条经典信号途径的网络调控
• 6.1 前言
• 6.2 RTN3 对外界刺激应激的超表达，诱导内质网依赖的细胞凋亡
• 6.3 RTN3 诱导的内质网凋亡途径与线粒体途径的CROSS TALKING
• 6.4 RTN3 诱导的内质网凋亡途径与死亡受体途径的CROSS TALKING
• 6.5 RTN3 与BCL2 结合抑制了其凋亡诱发活性
• 研究总结和创新点
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表和待发表的论文
• 致谢