预防性人乳头瘤病毒病毒样颗粒疫苗的研究

论文摘要

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)有100多型别,根据与致癌性的关系分为高危型和低危型。高危型HPV与人类多种组织恶性肿瘤密切相关,尤其以HPV16、18、31、45、52和58型感染与宫颈癌的发生关系最为密切,其中HPV16占50%以上。本论文针对HPV开展了以下三方面的研究:(1)利用荧光素酶基因为报告基因与含有HPV6、16、18、31、45、52和58型L1、L2衣壳蛋白基因的真核表达质粒共转染293FT细胞,获得带有荧光素酶基因的七种假病毒,建立了针对七种亚型中和抗体的快速、灵敏、准确的检测方法。(2)利用HPV6、16、18、31、45、52、58等七种真核表达质粒免疫小鼠,考察七种亚型间中和抗体交叉保护情况,结果显示:HPV6、HPV16和HPV18免疫血清对HPV52与HPV58假病毒中和阻断率小于24.1%(p>0.05);HPV58免疫血清对几种假病毒的中和阻断率分别为:HPV6(86.1%,p<0.01)、HPV16(30.9%,p>0.05)、HPV18(60.2%,p<0.005)、HPV45(36.1%,p<0.05)和HPV52(11.7%,p>0.05)。(3)根据中国部分地区和世界范围内相关流行病学研究结果,同时结合中和抗体交叉保护的关系,确定HPV16和58型为中国地区疫苗设计主要型别。分别利用大肠杆菌表达系统和毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达系统表达HPV16和58型的L1蛋白,其中原核表达体系表达的L1经过变性和复性过程,可形成L1五聚体;酵母表达体系分泌表达L1蛋白,可形成病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLPs),直径约为50nm。免疫动物结果显示:HPV16和58型两种形式疫苗均可产生中和抗体;在免疫血清阻断假病毒感染的能力和疫苗免疫原性方面,病毒样颗粒疫苗优于五聚体疫苗。本论文研究结果为进一步研制适合中国和东亚地区的HPV预防性疫苗奠定基础。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 1.1 人乳头瘤病毒研究概述
• 1.1.1 HPV分类与型别
• 1.1.2 HPV的结构与功能
• 1.1.3 HPV的致病机理
• 1.1.4 HPV的流行病学
• 1.2 HPV与人类肿瘤
• 1.2.1 机体对HPV的免疫反应
• 1.2.2 预防和治疗HPV感染的免疫学策略
• 1.3 人乳头瘤病毒疫苗研究现状
• 1.3.1 不同形式的HPV疫苗
• 1.3.2 HPV病毒样颗粒预防性疫苗研究现状
• 1.3.3 预防性HPV疫苗临床有效性评价
• 1.4 表达策略选择
• 1.4.1 传统的表达体系
• 1.4.2 毕赤酵母表达体系简介
• 1.5 本论文的设计思想
• 第二章 建立HPV中和抗体评价体系及七种型别中和抗体交叉保护研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 培养基及溶液配制
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 建立中和抗体检测方法的选择
• 2.2.2 假病毒的制备及病毒滴度测定
• 2.2.3 HPV七种型别中和抗体之间的交叉保护
• 2.2.4 HPV疫苗组份型别的确定标准
• 2.3 小结
• 第三章 HPV16、58 型重组毕赤酵母菌株的获得及病毒样颗粒的纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.1.3 培养基及溶液配制
• 3.1.4 方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 五种L1 基因的扩增与真核表达质粒的构建
• 3.2.2 五种酵母重组子的获得
• 3.2.3 筛选高表达重组子
• 3.2.4 HPV16L1 和HPV58L1 重组蛋白的获得
• 3.3 小结
• 第四章 HPV16、58L1 蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及复性
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 仪器与设备
• 4.1.3 培养基及溶液配制
• 4.1.4 方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 HPV16、58L1 蛋白的表达
• 4.2.2 HPV16、58L1 蛋白的复性
• 4.2.3 原核表达HPV16、58L1 复性后蛋白形式的确定
• 4.3 小结
• 第五章 HPV16、58 型两种疫苗形式免疫原性比较研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 仪器与设备
• 5.1.3 溶液配制
• 5.1.4 方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 HPV16、58L1 两种疫苗剂量及免疫途径的选择
• 5.2.2 HPV疫苗假病毒在中和抗体检测中稀释度的确定
• 5.2.3 HPV五聚体疫苗的中和抗体检测
• 5.2.4 HPV16L1 和HPV58L1 病毒样颗粒疫苗的中和抗体检测
• 5.2.4.1 HPV16L1 病毒样颗粒疫苗的中和抗体检测
• 5.2.4.2 HPV58L1 病毒样颗粒疫苗的中和抗体检测
• 5.2.4.3 HPV16L1 和 HPV58L1 双价病毒样颗粒疫苗的中和抗体检测
• 5.2.5 HPV16 和HPV58 双价疫苗对七种假病毒的中和阻断
• 5.3 小结
• 5.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 作者简历