靶向细菌16S rRNA核酸抗菌素的初步研究

论文摘要

目的:反义技术的发展为研发新一代抗菌药物提供了新思路。本研究以大肠杆菌16S rRNA为药物作用靶标,运用本实验室建立的MAST技术平台筛选其反义核酸作用靶点;通过体外和胞内实验对筛选靶点的有效性进行验证,以期获得能高效结合反义寡核苷酸的靶点序列;根据有效作用靶点合成硫代反义寡核苷酸研究其抑菌效果,为研发新一代核酸抗菌药物进行有益探索。方法:通过在转录16S rRNA过程中引入生物素标记的UTP,将其固定到亲和素磁珠上,保持RNA的自然折叠状态。然后与寡核苷酸文库杂交,筛选能结合的文库序列从而阐明靶点,该方法即为MAST技术（mRNA accessible site tagging）。运用该技术筛选获得16S rRNA6个反义寡核苷酸结合靶点。根据靶点,设计并合成6条靶点特异的反义寡核苷酸和5条10-23型脱氧核酶（DNAenzyme）。采用反义寡核苷酸依赖RNase H切割技术对6条反义寡核苷酸体外对16S rRNA的结合能力进行检测,并采用10-23型脱氧核酶催化切割技术对其中5条脱氧核酶的体外结合切割活性进行检测。经体外验证,所筛6个靶点中5个靶点为16S rRNA可及位点,其中靶点Ⅴ（907-926nt）结合活性最好。然后,构建原核表达载体用IPTG诱导表达单倍体锤头状核酶（sRZ）和双倍体锤头状核酶（dRz）,利用表达的核酶胞内特异降解16S rRNA抑制大肠杆菌生长,对靶点Ⅴ胞内有效性进行验证。针对体外和胞内验证有高效结合活性的靶点Ⅴ,合成硫代反义寡核苷酸与通透性好的大肠杆菌SM101温育,检测其对大肠杆菌生长的抑制效果,进行核酸抗菌素的初步研究。结果:运用MAST技术筛选获得位于16S rRNA 179-198、446-465、497-516、887-906、907-926、1236-1255nt6个靶点（Ⅰ-Ⅵ）;反义寡核苷酸依赖RNase H切割活性分析结果显示,靶点Ⅱ-Ⅵ为反义寡核苷酸体外高效结合靶点;脱氧核酶催化切割活性分析结果显示,靶点Ⅴ体外活性最为显著;胞内验证结果表明,针对靶点Ⅴ的单倍体和双倍体核酶对大肠杆菌生长均有抑制效果,且双倍体核酶效果更为显著;针对靶点Ⅴ的硫代反

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 MAST技术和16S rRNA靶点的筛选
• 摘要
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 16S rRNA基因的获得及确认
• 2.2 体外转录生成生物素标16S rRNA
• 2.3 寡核苷酸文库的设计与合成
• 2.4 rRNA的固定
• 2.5 分子杂交获得与16S rRNA结合的寡核苷酸序列
• 2.6 靶点的阐明
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 总结
• 第二部分 靶点有效性的体外验证
• 摘要
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 反义寡核苷酸和DNAenzyme的设计和合成
• 2.2 采用反义寡核苷酸依赖RNase H体外切割活性分析
• 2.3 采用DNAenzyme体外切割活性分析
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 总结
• 第三部分 靶点有效性的细胞内验证
• 摘要
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 pET-28a（+）载体的改建
• 2.2 16SdRz和16SsRZ序列的设计和目的片段的获得
• 2.3 pET-28a（+）-EcoRI-16SdRz和pET-28a（+）-EcoRI-16SsRz重组质粒的获得
• 2.4 16SdRz和16SsRz对大肠杆菌生长的抑制
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 总结
• 第四部分 反义寡核苷酸对细菌生长的抑制
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 硫代反义寡核苷酸的设计与合成
• 1.2.2 大肠杆菌SM101的纯化
• 1.2.3 硫代反义寡核苷酸对大肠杆菌SM101生长抑制的检测
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 4 总结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 文献综述
• 附录
• 1 生成随机反义寡核苷酸序列的SAS程序和结果
• 2 在读期间发表的论文和综述目录
• 3 在读期间发表的论文全文