胸膜肺炎放线杆菌TbpB-ELISA的建立及zmp和arcA/arcB基因的初步研究

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的病原菌,引起猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成严重的经济损失。该病原菌的毒力因子主要包括外毒素、脂多糖、荚膜多糖、外膜蛋白、蛋白酶等。转铁结合蛋白（Tbp）是APP重要的膜蛋白,为所有血清型所共有,用于铁离子的获取。zmp基因编码的金属蛋白酶可在宿主体内表达,预测是APP重要的毒力因子,与APP在宿主呼吸道上皮细胞的吸附定殖过程中起重要作用。ArcA-ArcB二元调控系统参与APP厌氧呼吸相关基因的表达调控,可能对APP的代谢和毒力有重要的影响。本研究主要包括以下三个方面内容:1.胸膜肺炎放线杆菌tbpB基因的克隆表达与间接ELISA方法的建立转铁结合蛋白（TbpA和TbpB）是胸膜肺炎放线杆菌重要的膜蛋白,其中TbpB位于细菌表面,在APP的致病性和免疫反应中起着重要的作用。本试验用PCR方法克隆了APP血清1型菌的tbpB基因的编码区（1,644bp）,在大肠杆菌中进行了高效表达。用纯化的表达产物建立了ELISA检测方法,对其特异性、敏感性进行了测试,与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究,并用该方法检测了临床血清980份。结果表明TbpB-ELISA方法有较好的敏感性,但特异性较差,检测的临床血清的阳性率为53.57%,所检测的阳性率尽管不能完全反映猪传染性胸膜肺炎的流行情况,但在一定程度上可以对猪传染性胸膜肺炎的流行情况提供参考。2.胸膜肺炎放线杆菌金属蛋白酶（zmp）基因的研究根据已知的APP血清1型的zmp基因序列,用PCR方法克隆了其全长编码序列（2,610bp）,在大肠杆菌中获得了高效表达;用特异蛋白底物检测了重组蛋白的蛋白酶活性;先后尝试了三种zmp基因缺失突变体构建方法,最终成功构建了APP血清1型zmp基因部分缺失突变株,并对突变株的生长特性进行了研究,对突变株与亲本株的毒力作了比较。结果表明重组蛋白在酪蛋白等特定底物存在时表现出相应的蛋白酶活性;zmp基因部分缺失突变株与亲本株的体外生长特性未见明显差异,提示zmp基因对APP体外生长影响不大;毒力比较表明zmp基因部分缺失突变株比亲本株的毒力有15-20倍下降,提示zmp基因对APP毒力有一定影响。3.胸膜肺炎防线杆菌ArcA-ArcB二元调控系统的研究根据已公布的APP基因组序列,通过与大肠杆菌等细菌基因组的比较,找出了APP基因组中存在的五组二元调控系统,并选择了厌氧呼吸控制系统ArcA-ArcB系统进行了研究。主要目的是构建单基因和双基因缺失突变株,并利用基因芯片的方法研究ArcA-ArcB系统所调控的基因,进而探讨其对厌氧呼吸条件下对APP与宿主相互作用的影响。在本论文中主要完成了前期分析工作,并构建了相应的同源重组缺失突变体载体,为后续研究作了准备。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎及其危害
• 1.2 胸膜肺炎放线杆菌（APP）
• 1.2.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现
• 1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌的基本特征
• 1.2.3 毒力相关因子
• 1.3 胸膜肺炎放线杆菌的检测和诊断方法
• 1.3.1 乳胶凝集试验（LAT）
• 1.3.2 琼脂扩散试验（GDT）
• 1.3.3 补体结合试验（CFT）
• 1.3.4 间接血凝试验（IHA）
• 1.3.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.3.6 凝集试验
• 1.3.7 环状沉淀实验（RPT）
• 1.3.8 间接荧光抗体试验（IFAT）
• 1.4 APP突变株构建方法的研究进展
• 1.4.1 自然突变
• 1.4.2 人工化学诱变
• 1.4.3 转座子突变技术
• 1.4.4 同源重组技术
• 1.5 细菌二元调控系统（TCS）的研究现状
• 1.5.1 二元调控系统的基本结构与作用机理
• 1.5.2 细菌二元调控系统的主要功能
• 1.5.3 胸膜肺炎放线杆菌中的二元调控系统
• 第二章 胸膜肺炎放线杆菌tbpB基因的克隆表达与间接ELISA方法的建立
• 2.1 研究的目的意义
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 血清
• 2.2.3 主要酶以及试剂盒来源
• 2.2.4 培养基、抗生素配制
• 2.2.5 寡核甘酸引物
• 2.2.6 使用溶液及储存液
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 表达载体的构建方法
• 2.3.2 表达载体的构建
• 2.3.3 重组质粒的诱导表达
• 2.3.4 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.5 TbpB蛋白的制备
• 2.3.6 Western-blot
• 2.3.7 蛋白质浓度的测定（BAC分析）
• 2.3.8 胸膜肺炎放线杆菌抗原的制备
• 2.3.9 间接ELISA最佳抗原包被浓度和血清最佳稀释度的确定
• 2.3.10 TbpB-ELISA临界值的确定
• 2.3.11 TbpB-ELISA特异性和敏感性实验
• 2.3.12 TbpB的生物信息学分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 tbpB基因的克隆、原核表达、包涵体的提取
• 2.4.2 Western-blot分析
• 2.4.3 BAC法测定重组蛋白浓度
• 2.4.4 间接ELISA抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定
• 2.4.5 TbpB-ELISA临界值的确定
• 2.4.6 TbpB-ELISA特异性和敏感性实验
• 2.4.7 TbpB蛋白的生物信息学分析
• 2.5 讨论
• 第三章 胸膜肺炎放线杆菌zmp基因的研究
• 3.1 研究的目的意义
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 菌株、质粒和培养条件
• 3.2.2 主要溶液的配制
• 3.2.3 培养基及抗生素的配制
• 3.2.4 酶、抗生素及试剂盒
• 3.2.5 寡聚核苷酸引物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细菌的复苏、增殖及基因组的提取
• 3.3.2 PCR产物和酶切产物的回收与纯化
• 3.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.3.4 APP电转化感受态细胞的制备
• 3.3.5 连接产物的转化
• 3.3.6 质粒的制备
• 3.3.7 重组质粒的鉴定
• 3.3.8 zmp基因在BL21中的诱导表达
• 3.3.9 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
• 3.3.10 zmp基因编码蛋白的活性测定
• 3.3.11 胸膜肺炎放线杆菌的PCR鉴定
• 3.3.12 细菌RNA提取
• 3.3.13 RT-PCR
• 3.3.14 zmp基因全基因及前后臂片段的克隆与鉴定
• 3.3.15 自杀性质粒pEMΔZMP的构建与zmp基因缺失菌株的筛选
• 3.3.16 pSKALZ诱导型同源重组载体的构建、突变株的筛选与分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 zmp基因的克隆表达与重组蛋白活性分析
• 3.4.2 重组自杀性质粒PEMΔZMP的构建与突变株筛选
• 3.4.3 pSKALZ诱导型同源重组载体的构建、突变株筛选及分析
• 3.5 讨论
• 第四章 胸膜肺炎放线杆菌ArcA-ArcB二元调控系统的研究
• 4.1 研究目的与意义
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 寡核甘酸引物
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 主要试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 细菌的增殖
• 4.3.2 细菌PCR模板制备
• 4.3.3 PCR扩增
• 4.3.4 限制性酶切
• 4.3.5 从凝胶中回收目的片段
• 4.3.6 DNA片断的连接
• 4.3.7 感受态的制备及转化
• 4.3.8 碱裂解法小量制备质粒DNA
• 4.3.9 胸膜肺炎放线杆菌电转感受态细胞的制备及转化
• 4.3.10 接合转移与胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株的构建
• 4.4 结果分析
• 4.4.1 重组自杀质粒pEMOCAUD的构建
• 4.4.2 重组自杀质粒pEMOCBUD的构建
• 4.5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢