论文摘要
猪圆环病毒Ⅱ（PCV-2）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）是引发猪疫病的常见病原，且在临床上常呈混合感染出现，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。建立快速、准确、高通量的检测方法是有效预防和控制相关疫病的关键。目前对这3种病毒的诊断多采用病原分离及各种常规的血清学方法进行，其操作繁琐、费时费力且灵敏度较差。分子生物学方面，虽然已有PCR技术应用于病毒检测，但对不同病毒需分别进行诊断，且非特异产物的增多也容易导致临床误诊。本研究旨在建立一种基于寡核苷酸芯片技术的可同时、快速、高通量检测引发猪疫病常见病原的方法。首先，应用生物信息学方法，针对病毒基因组保守序列设计特异性强的60-mer寡核苷酸探针，并固定于经氨基化修饰的片基上，制备出寡核苷酸芯片。然后针对三种病原分别设计出相应的引物，对样本进行不对称PCR扩增，产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA，并通过间接荧光标记技术使其标记上荧光物质。将标有荧光物质的扩增产物与芯片杂交，通过芯片扫描、分析荧光信号从而达到对病原检测的目的。在研究过程中，对样本处理、不对称PCR操作及杂交条件等过程进行探索和优化。以上述三种病毒为检测模型，对寡核苷酸芯片技术平台体系的灵敏度和特异性进行评估和鉴定。通过试验，本研究获得了以下成果：（1）制作出背景低，特异性高的寡核苷酸芯片；（2）通过优化实验，确定了不对称PCR扩增的条件；（3）通过间接荧光标记技术引入报告基团，在杂交温度为60℃，杂交时间为12h的条件下，能够得到强而稳定的荧光信号；（4）由扫描结果可以看出三种病毒样本均可在相应的探针位置处呈现出阳性荧光信号，而阴性对照和空白对照则基本检测不到荧光信号，并且各个病毒之间也不存在交叉杂交现象；（5）应用该技术平台可检测到少至10个拷贝的PCV2、PPV基因和100个拷贝的CSFV基因。研究表明，我们所建立的寡核苷酸芯片检测技术平台操作简单、结果准确、灵敏度高、特异性强、并具有高通量、快速检测多种病原的优点。该技术的完成和应用将可大大完善我国对疫病诊断的技术体系，最大程度地减少疫病带来的经济损失，具有十分重大的意义。