农杆菌介导3α-HSD基因转化果蔗的研究

论文摘要

人类经济快速发展，大量的废气、废水、废物等排放到环境中，导致环境污染日益严重。3α-HSD基因是睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）的关键酶3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase，3a-HSD/CR）基因，对环境污染物中的类固醇化合物有很好的降解作用。本试验以果蔗品种宁德、福安为材料，进行农杆菌介导的果蔗遗传转化3α-HSD基因的研究，并对得到的阳性植株在分子水平、蛋白水平和功能方面进行分析检测，得出以下结果：1、对果蔗组织培养的不同培养阶段的培养基进行选择，选择后的诱导培养基为MS+2mg/L2,4-D；分化培养基为MS+1mg/L NAA+2mg/L6-BA；促根培养基为1/2MS+1.5mg/LNAA。2、在愈伤阶段、分化阶段、生根阶段进行潮霉素抗性筛选试验，试验结果表明：潮霉素对不同阶段的敏感性存在一定的差异，组培苗分化和生根的培养对潮霉素的敏感性要高于愈伤组织的培养。对于愈伤组织的筛选潮霉素以40-50mg/L为宜，分化和生根的培养以30mg/L为宜。3、通过农杆菌介导法将含有3α-HSD基因的载体导入到果蔗基因组DNA中，获得阳性植株。经PCR检测，在分化出的62株植株中，宁德获得6株转基因植株、福安获得2株转基因植株。将PCR得到的特异片段回收、测序，其序列与3α-HSD基因序列相同，同源性达99%。PCR-Southern blot、GUS染色进一步验证了3α-HSD基因已成功导入并整合到果蔗基因组DNA中。4、对转3α-HSD基因的果蔗叶片进行ELISA检测，以非转基因果蔗做为对照，检测结果表明：3α-HSD基因在转基因果蔗基因组DNA中得到表达，3α-HSD蛋白的表达量高于对照。5、通过对转基因果蔗进行胆固醇降解实验，并严格设立阴性对照，检测结果表明：转基因果蔗的降解率高于对照，平均降解率达80%左右，高于对照25%左右。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 果蔗简述
• 1.2 果蔗育种的研究现状
• 1.3 睾丸酮丛毛单胞菌的研究概况
• 1.3.1 类固醇化合物
• 1.3.2 羟类固醇脱氢酶（HSDs）的特性
• 1.3.3 睾丸酮丛毛单胞菌关键酶 3a-HSD/CR 表达调控
• 1.4 果蔗遗传转化研究概况
• 1.4.1 基因枪法
• 1.4.2 电击法
• 1.4.3 PEG 法
• 1.4.4 农杆菌介导法
• 1.5 转基因植物存在的问题
• 1.5.1 基因沉默
• 1.5.2 基因突变
• 1.6 转基因技术在植物修复中的应用
• 1.6.1 转基因植物修复污染物研究现状
• 1.6.2 提高转基因植物修复效率的方法
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试果蔗品种
• 2.1.2 供试菌株和质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 电泳缓冲液
• 2.1.5 Southern blot 缓冲液
• 2.1.6 引物
• 2.1.7 组培主要试剂
• 2.1.8 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒导入农杆菌菌株
• 2.2.2 果蔗心叶诱导胚性愈伤组织
• 2.2.3 农杆菌介导的果蔗遗传转化方法
• 2.2.3.1 培养基的选择
• 2.2.3.2 潮霉素抗性筛选试验
• 2.2.3.3 农杆菌介导的果蔗遗传转化
• 2.2.4 阳性植株的 PCR 分析
• 2.2.4.1 HSD 基因 PCR 分析
• 2.2.4.2 阳性植株 PCR-Southern blot 检测
• 2.2.5 阳性植株的 GUS 活性检测
• 2.2.6 转基因植株后代的 ELISA 检测
• 2.2.7 转基因果蔗降解胆固醇能力的测定
• 3 结果分析
• 3.1 果蔗遗传转化再生体系培养基的选择
• 3.1.1 诱导愈伤组织培养基的选择
• 3.1.2 分化培养基的选择
• 3.1.3 生根培养基的选择
• 3.2 潮霉素抗性筛选试验
• 3.2.1 潮霉素对甘蔗愈伤组织的影响
• 3.2.2 潮霉素对甘蔗愈伤组织分化成芽的影响
• 3.2.3 潮霉素对苗生根的影响
• 3.2.4 潮霉素浓度对诱导、分化、生根的影响
• 3.3 农杆菌介导的果蔗遗传转化
• 3.3.1 质粒 pBR-HSD 的酶切验证
• 3.3.2 pBR-HSD 的测序结果
• 3.3.3 农杆菌中质粒目的基因的 PCR 鉴定
• 3.3.4 农杆菌介导法获得阳性植株
• 3.4 转基因果蔗阳性植株的 PCR 检测
• 3.4.1 HSD 基因 PCR 检测结果分析
• 3.4.2 PCR 产物测序结果
• 3.5 转化植株的 PCR-Southern 杂交结果分析
• 3.6 转基因果蔗植株叶片 GUS 组织化学染色结果分析
• 3.7 转基因果蔗 ELISA 蛋白表达分析
• 3.8 转基因果蔗降解胆固醇能力分析
• 4 讨论
• 4.1 不同基因型对甘蔗心叶诱导愈伤组织的影响
• 4.2 果蔗组织培养不同阶段对潮霉素的敏感性
• 4.3 影响遗传转化的因素
• 4.4 阳性植株的分子验证
• 4.5 3α-HSD 基因在果蔗中的表达
• 4.6 转 3α-HSD 基因果蔗降解胆固醇的分析
• 4.7 后续研究工作
• 5 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 附录Ⅲ
• 附录Ⅳ
• 致谢