论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）又称震颤性麻痹,由英国医生詹姆斯·帕金森（James Parkinson）于1817年首次报告。PD的主要临床表现包括静止性震颤、动作迟缓、肌强直以及姿势障碍,严重影响着患者的生活质量。其主要病理变化为中脑黑质多巴胺能神经元进行性退变,导致纹状体内神经递质多巴胺（dopamine,DA）不足而发病。迄今为止,PD的病因和发病机制还未完全明确。有人提出,氧化应激和线粒体功能障碍导致的多巴胺神经元凋亡参与了PD的发病过程。尸检表明,PD患者黑质部位多巴胺神经元数目明显减少,并存在凋亡样形态学改变,氧化应激产生的超氧化物（reactiveoxygen species,ROS）增多,脂质过氧化增强,丙二醛（malondialdehvde,MDA）生成增加,谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平降低,线粒体功能障碍。用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）、6-羟基多巴（6-hydroxydopamine,6-OHDA）和鱼藤酮制作的PD体内大鼠或小鼠模型表明,黑质部位多巴胺神经元数目明显减少,并存在凋亡样形态学改变,ROS生成增多,MDA水平上升,GSH水平降低,线粒体功能障碍,跨膜电位下降,三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）生成减少。体外培养的多巴胺神经元和细胞系如大鼠嗜铬细胞瘤细胞（rat pheochromocytoma cell line,PC12）和神经母细胞瘤细胞（neuroblastomacell line,SH-SY5Y）经上述毒素处理后制作的PD体外模型,细胞活力下降,并呈现凋亡样改变,细胞凋亡率上升,部分抗凋亡基因表达下降,促凋亡基因表达上升,caspase-3活性升高,氧化应激增强,细胞内ROS升高,脂质过氧化增强,MDA升高,细胞内GSH下降,线粒体功能障碍,跨膜电位降低,ATP生成减少。因此,氧化应激和线粒体功能障碍导致的多巴胺神经元凋亡是PD发病的可能机制之一。以左旋多巴（L-dopa,多巴胺的中间前体）及其复方制剂为主的替代疗法是目前治疗PD最常用的有效缓解症状的药物。但是,临床上人们认识到,替代疗法仅能改善临床症状,并不能延缓该病的进程。并且体内、外实验研究证明,L-dopa及其复方制剂对多巴胺能神经元还有一定的毒性作用,因此并不能从根本上治疗PD,故现今的主要研究方向在于寻求一种能延缓疾病进程且有神经保护作用的治疗方案。研究证实,生酮饮食（ketogenic diet,KD）或酮体（ketone bodies,KB）的主要成份D-β-羟基丁酸（D-β-hydroxybutyrate,DβHB）具有神经保护作用。KD指的是高脂肪、低蛋白、低碳水化合物饮食,通过大量脂肪摄入,使体内的KB产生增加形成慢性酮症状态,1921年由Wilder首次介绍并应用于临床,主要用于治疗儿童甚至成人药物难治性（顽固性）癫痫,对发作控制有效率达66.7%。最近Van Itallie等临床研究表明,给予PD患者严格的KD,使其血浆KB水平升至1-7 mM（正常值为0.03-0.5 mM）。一月以后,根据帕金森氏病统一评价标准（Unified Parkinson Disease Rating Scale,UPDRS）进行评分,结果显示与治疗前相比平均降低43%,并且患者自我感觉病情好转。另外体内、外实验表明:KD及由KD产生的KB具有神经保护作用,如KD及其外源性给予KB的主要成份DβHB或其钠盐（D-β-hydroxybutyrate sodium,DβHB Na）对急、慢性神经损伤和退变具有神经保护作用;DβHB Na对由缺氧引起的体外原代海马神经元损伤具有保护作用;持续静脉注射DβHB对MPTP引起的小鼠多巴胺神经元退变具有抑制作用,运动行为改善,ATP生成增加;DβHB抑制了1-甲基-4苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+）引起的体外多巴胺神经元损伤,对鱼藤酮引起的多巴胺能SH-SY5Y细胞损伤也具有保护作用。基于以上研究,我们将对KD和KB及其主要成份DβHB对PD模型的神经保护作用及其机制做进一步的探讨。本课题用6-OHDA损伤制作PD体内和体外模型。在体内模型中,利用Wistar大鼠给予KD预处理;在体外模型中,利用PC12给予KB的主要成分DβHB预处理。应用Nissl染色、免疫组织化学、高效液相色谱（high performanceliquid chromatography,HPLC）、细胞活力测定、倒置显微镜观察、丫啶橙（acridine orange,AO）染色、流式细胞计、反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptase polymerase chain reaction,RT-PCR）和多功能酶标仪等技术,从多巴胺神经元保护、抗凋亡、抗氧化和维持线粒体功能等方面对KD及其主要成分DβHB治疗PD的机制进行研究,为KD治疗PD的方法探索实验依据,为PD的神经保护治疗提供可靠的理论基础。本实验分为5部分,摘要如下:第一部分KD对黑质多巴胺神经元的保护作用目的:研究KD对大鼠黑质多巴胺神经元的保护作用。方法:首先给予Wistar大鼠正常饮食（normal diet,ND）和KD预处理2周后,用6-OHDA两点注射右侧纹状体。实验共分4组,每组5只:ND组、KD组、6-OHDA+ND组和6-OHDA+KD组。注射6-OHDA后继续维持ND或KD处理两周,用Nissl染色及酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）免疫组化染色检测各组大鼠黑质部位TH阳性神经元数目的变化,TH免疫组化染色检测纹状体TH阳性纤维密度的改变,HPLC检测纹状体内DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸（dihydroxy-phenylaceticacid,DOPAC）和高香草酸（homovanillic acid,HVA）的含量的变化,分析KD对大鼠黑质多巴胺神经元的保护作用。结果:1.Nissl染色及TH免疫组化表明:ND大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA两周后,引起右侧黑质部位多巴胺能神经元退变,与未注射6-OHDA的ND大鼠相比较,多巴胺神经元数目明显减少,P＜0.01;而给予KD预处理的大鼠,右侧纹状体内注射6-OHDA两周后,黑质部位多巴胺神经元与6-OHDA+ND组大鼠相比较,数目明显增多,P＜0.05;不经6-OHDA处理的ND组和KD组大鼠相比较,黑质部位多巴胺神经元数目无明显差别,P＞0.05。TH免疫组化染色表明:ND大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA两周后,引起右侧纹状体部位多巴胺神经元纤维末梢光密度值降低,与未注射6-OHDA的ND组大鼠相比较明显降低,P＜0.01;而给予KD预处理的大鼠,右侧纹状体内注射6-OHDA两周后,多巴胺神经元纤维末梢光密度值与6-OHDA+ND组大鼠相比较明显升高,P＜0.05;不经6-OHDA处理的ND组和KD组大鼠相比较,多巴胺神经元纤维末梢光密度无明显差别,P＞0.05。2.HPLC结果表明:ND大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA两周后,引起右侧纹状体内DA及其代谢产物DOPAC和HVA明显降低,与未注射6-OHDA的ND组大鼠相比较,P＜0.01;而给予KD预处理的大鼠,右侧纹状体内注射6-OHDA两周后,右侧纹状体内DA及其代谢产物DOPAC与6-OHDA+ND组大鼠相比较明显升高,P＜0.05,HVA升高,但无明显差别,P＞0.05;不经6-OHDA处理的ND组和KD组大鼠相比较,右侧纹状体内DA及其代谢产物DOPAC和HVA无明显差别,P＞0.05。结论:KD对大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用第二部分DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞凋亡的影响目的:研究DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞凋亡的影响。方法:首先给予PC12细胞DβHB（终浓度为4 mM）预处理10 min,然后将6-OHDA（终浓度为50和100μM）加入到体外培养的PC12培养液中,继续培养24h。实验分为5组:对照组、50μM 6-OHDA组、100μM 6-OHDA组、4 mM DβHB+50μM 6-OHDA组和4 mM DβHB+100μM 6-OHDA组。用四唑盐（3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-yl）-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT）比色法测定各组细胞活力,倒置显微镜观察各组细胞形态变化,AO染色观察各组细胞凋亡的形态学改变,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果:经6-OHDA（终浓度为50和100μM）处理的PC12细胞,细胞活力明显下降,分别为对照组的75.77±0.84%和47.16±2.37%,与对照组相比较,P＜0.01。倒置显微镜及AO染色显示,细胞死亡增加,细胞皱缩,突起变短,呈现凋亡的形态学变化,上述变化依据6-OHDA浓度变化而变化,具有浓度依赖性的特点。流式细胞仪结果表明,细胞凋亡率升高,分别为27.17±2.64%和37.89±2.39%（对照组为1.94±0.52%）,与对照组相比较,P＜0.05。给予DβHB（终浓度为4 mM）预处理的PC12细胞经6-OHDA处理24 h后,细胞活力升高,分别为对照组的86.62±1.66%和65.74±1.49%,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.01。倒置显微镜及AO染色显示,细胞死亡减少,细胞皱缩减轻,突起变长,凋亡程度减轻,流式细胞仪结果表明,细胞凋亡率降低,分别为19.38±3.20%和33.24±2.32%,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.05。结论:DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞凋亡有抑制作用。第三部分DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞bcl-2/bax mRNA表达及caspase-3活性变化的影响目的:研究DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞bcl-2/bax mRNA表达及caspase-3活性变化的影响。方法:细胞培养、药物处理及分组同第二部分。用RT-PCR方法检测bcl-2mRNA和bax mRNA表达情况并计算bcl-2/bax mRNA比值,用多功能酶标仪检测caspase-3活性的变化。结果:半定量RT-PCR方法检测发现,6-OHDA（终浓度为50和100μM）引起了bcl-2 mRNA表达降低,bax mRNA表达升高,bcl-2/bax mRNA比值降低,与对照组相比较,P＜0.05。caspase-3活性升高,为对照组的125.83±1.54%和146.27±2.41%,与对照组相比较,P＜0.05。给予DβHB（终浓度为4 mM）预处理的PC12细胞经6-OHDA处理24 h后,bcl-2 mRNA升高,bax mRNA降低,bcl-2/bax mRNA比值升高,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.05。caspase-3活性降低,为对照组的115.61±2.75%和132.75±3.11%,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.05。结论:6-OHDA引起了PC12细胞bcl-2/bax mRNA比值表达降低,caspase-3活性升高,DβHB对上述变化具有抑制作用。第四部分DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞氧化应激的影响目的:观察DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞氧化应激的影响。方法:细胞培养、药物处理及分组同第二部分。用多功能酶标仪检测检测细胞内ROS、MDA和细胞内GSH含量的变化。结果:6-OHDA（终浓度为50和100μM）引起了PC12细胞内ROS升高,分别为对照组的167.69±9.40%和289.8±9.42%,与对照组相比较,P＜0.05;MDA升高,分别为对照组的201.24±9.68%和291.18±17.59%,与对照组相比较,P＜0.05;细胞内GSH降低,分别为对照组的75.45±4.97%和53.98±3.20%,与对照组相比较,P＜0.05。给予DβHB（终浓度为4 mM）预处理的PC12细胞经6-OHDA处理24 h后,细胞内ROS降低,分别为对照组的155.57±6.32%和275.53±8.28%,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.05;MDA降低,分别为对照组的156.33±9.07%和220.37±19.81%,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.05;细胞内GSH升高,分别为对照组的82.29±0.78%和61.01±4.36%,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.05。结论:DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞氧化应激具有抑制作用。第五部分DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞线粒体功能障碍的影响目的:观察DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞线粒体功能障碍的影响。方法:细胞培养、药物处理及分组同第二部分。多功能酶标仪检测线粒体膜电位和ATP水平变化情况。结果:6-OHDA（终浓度为50和100μM）引起了PC12细胞线粒体膜电位明显下降,为对照组的78.81±2.96%和42.01±2.95%,具有浓度依赖性,与对照组相比较,P＜0.05;ATP生成减少,为对照组的62.23±4.46%和32.2±4.37%,具有浓度依赖性,与对照组相比较,P＜0.05。给予DβHB（终浓度为4 mM）预处理10 min的PC12细胞经6-OHDA处理24 h后,PC12细胞线粒体膜电位明显升高,为对照组的88.79±3.36%和59.29±4.72%,与相对应的6-OHDA组相比较,P＜0.05;ATP生成明显增多,为对照组的85.25±4.65%和58.94±4.84%,与不同浓度6-OHDA组相比较,P＜0.05。结论:DβHB对6-OHDA引起的PC12细胞线粒体膜电位明显下降和ATP生成减少具有抑制作用。
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