大熊猫γ-干扰素基因克隆、原核表达及真核表达载体构建

论文摘要

γ-干扰素（IFN-γ）主要是由活化的Th1细胞、CD8+T细胞和NK细胞产生，除具有抗病毒和抗肿瘤活性外，免疫调节作用是其主要的生物学功能，如：激活巨噬细胞、上调MHCI、Ⅱ类分子表达水平和促进抗原提呈，诱导Th细胞的分化等，在机体针对肿瘤及多种胞内病原体感染等疾病的细胞免疫中发挥重要的作用，是体现机体免疫功能的一项重要指标。大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是我国特有的珍稀野生动物，被誉为中国的“国宝”。据国家林业总局最新公布的调查数字，野生大熊猫现存数量在1590只左右，人工圈养的大熊猫也仅有189只，它们仍处于绝灭的边缘。长期人工圈养的大熊猫（特别是幼年大熊猫和老龄化大熊猫）大多免疫力低下，抗病毒、细菌和寄生虫感染的能力相对较弱，对其疾病的防治目前仍以药物控制为主，并无专用疫苗，加上频繁用药导致耐药性菌（虫）株出现，以及药物自身存在的毒副作用，这些都给大熊猫的疾病防治及繁殖工作带来了很大的难度。因而为进一步搞好大熊猫的饲养管理及疾病控制，就需要研究新的防治技术，通过细胞因子的作用来提高大熊猫的自身免疫力将可能是一个相对有效的拯救措施之一。1．本试验应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫γ-干扰素基因，并将其克隆到PGEMT载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析，克隆得到的IFN-γ基因开放阅读框由498个核苷酸组成，编码一个由166个氨基酸组成的多肽，包括编码19个氨基酸的信号肽和147个氨基酸的成熟肽。与Genbank中其他哺乳动物的IFN-γ序列比较，它与犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的核苷酸同源性在57.7％（鼠）～93.2％（犬）之间；IFN-γ编码氨基酸同源性在46.8％（鼠）～92.8％（犬）之间；进化树构建结果表明大熊猫与犬的亲缘关系最近。2．本试验构建了IFN-γ基因全编码序列的原核表达质粒pET32aIFN-γ，并进行了原核表达研究。将克隆在PGEMT载体中的IFN-γ基因全编码序列插入原核表达载体pET32a，得到重组质粒pET32aIFN-γ，转化大肠杆菌BL21（表达菌株），IPTG诱导表达后，裂解菌体作SDS-PAGE分析，得到融合表达蛋白特异条带，该表达条带大小为34.6KDa（IFN-γ成熟蛋白为17.4 KDa，菌蛋白为17.2 KDa）。3．将克隆在PGEMT载体中的IFN-γ基因全编码序列经EcoRI和XhoI酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒回收纯化酶切产物，然后与同样酶切的pcDNA3.1（+）质粒定向连接并转化到大肠杆菌中，构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）IFN-γ，并用酶切分析和序列测定进行了鉴定，结果酶切分析和序列测定都证实真核表达质粒成功构建。本研究成功克隆了大熊猫IFN-γ基因，构建了原核和真核表达质粒，并进行了原核蛋白的表达。本研究为了解各物种间干扰素序列的进化关系提供理论依据，同时也为进一步研究IFN-γ重组蛋白的免疫学特性和生物学活性及其应用奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 干扰素的发现
• 1.2 干扰素的产生
• 1.3 干扰素诱导原
• 1.4 干扰素的作用原理
• 1.5 干扰素的基因工程学研究
• 1.6 IFN-γ生物学活性及应用
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 常用缓冲溶液和培养基的配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 主要生物信息学数据库和计算机软件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 大熊猫外周血淋巴细胞诱导培养
• 2.2.2 总RNA提取
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 第一链cDNA的合成
• 2.2.5 PCR扩增
• 2.2.6 PCR产物的回收
• 2.2.7 cDNA片段克隆及鉴定
• 2.2.7.1 IFN-γ片段与pGEMT载体连接
• 2.2.7.2 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备
• 2.2.7.3 连接产物转化感受态细胞
• 2.2.7.4 菌落PCR鉴定
• 2.2.7.5 质粒DNA的小量提取
• 2.2.7.6 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.8 序列测定与分析
• 2.2.9 克隆序列的GenBank登录
• 2.2.10 原核表达载体的构建
• 2.2.10.1 引物设计
• 2.2.10.2 重组YpGEMTIFN-γ质粒的构建与酶切
• 2.2.10.3 pET32a质粒的提取与酶切
• 2.2.10.4 连接
• 2.2.10.5 测序鉴定
• 2.2.11 重组pET32aIFN-γ质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.11.1 IPTG诱导重组表达菌的转录检测
• 2.2.11.2 融合蛋白的表达和样品的制备
• 2.2.11.3 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.2.12 真核表达载体的构建
• 2.2.12.1 引物设计
• 2.2.12.2 重组ZpGEMTIFN-γ质粒构建与酶切
• 2.2.12.3 pcDNA3.1（+）质粒的提取与酶切
• 2.2.12.4 连接及重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.12.5 测序鉴定
• 3 试验结果
• 3.1 IFN-γ基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 总RNA提取
• 3.1.2 RT-PCR
• 3.1.3 基因克隆
• 3.1.4 重组pGEMTIFN-γ质粒的酶切鉴定
• 3.1.5 重组pGEMTIFN-γ质粒的测序鉴定
• 3.1.6 序列分析
• 3.2 IFN-γ基因原核表达载体构建及表达
• 3.2.1 重组YpGEMTIFN-γ质粒的酶切
• 3.2.2 重组pET32aIFN-γ质粒的酶切鉴定
• 3.2.3 重组pET32aIFN-γ质粒的测序鉴定
• 3.2.4 IPTG诱导重组表达菌的转录检测
• 3.2.5 表达融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测
• 3.3 IFN-γ基因真核表达载体构建
• 3.3.1 重组ZpGEMTIFN-γ质粒的酶切
• 3.3.2 重组pcDNA3.1（+）IFN-γ质粒的酶切鉴定
• 3.3.3 重组pcDNA3.1（+）IFN-γ质粒的测序鉴定
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 重组pGEMTIFN-γ质粒测序报告图
• 附录2 重组pET32aIFN-γ质粒测序报告图
• 附录3 重组pcDNA3.1（+）IFN-γ质粒测序报告图
• 攻读硕士学位期间发表论文