感染性休克时Alpha-肾上腺素受体基因表达改变的机制及抗氧化剂的治疗作用

论文题目: 感染性休克时Alpha-肾上腺素受体基因表达改变的机制及抗氧化剂的治疗作用

论文类型: 硕士论文

论文专业: 急诊医学

作者: 廖丽君

导师: 景亮

关键词: 抗氧化剂,肾上腺素受体,基因表达,感染性休克,一氧化氮,血管平滑肌细胞,诱导型一氧化氮合酶

文献来源: 东南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 第一章抗氧化剂有效抑制细菌内毒素性休克大鼠α1-肾上腺素受体基因表达下调目的观察细菌内毒素性休克时大鼠α1-肾上腺素受体（α1-ARs）mRNA的表达状况及抗氧化剂的治疗作用。方法雄性SD大鼠40只,随机分成五组:①空白对照组（n = 8）;②内毒素休克组(LPS, 15 mg·kg-1静脉注射, n = 8);③丙泊酚组(LPS注入1 h后,丙泊酚10 mg·kg-1静脉注射,继以10 mg·kg-1静脉持续泵入,n = 8);④尿酸组(UA,LPS注入1 h后,腹腔注射UA 200 mg·kg-1,n = 8);⑤N-乙酰5-甲氧基色胺组(MLT,LPS注入1 h后,腹腔注射MLT 10 mg·kg-1,n = 8)。各组大鼠于注射LPS 6 h后处死,迅速留取胸主动脉、下腔静脉、心脏、肝脏、肺脏、肾脏组织。提取各组织的总RNA,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组织内α1A-AR、α1B-AR和α1D-AR mRNA的表达。结果与对照组比较,LPS组大鼠动脉、肝脏、肺脏、肾脏组织中的α1-ARs三个亚型mRNA的表达量均显著下降（p < 0.01）,静脉、心脏组织中α1A-AR、α1B-AR mRNA的表达量也显著下降（p < 0.01）。与LPS组相比,除MLT组无效外,丙泊酚组肺脏和肾脏组织中α1A-AR mRNA的表达明显逆转（p < 0.05）,动脉、肝脏、肺脏、肾脏组织中α1B-AR、α1D-AR的mRNA表达明显逆转（p < 0.05）,静脉和心脏组织中α1B-AR mRNA的表达也显著逆转（p < 0.05）。与LPS组相比,尿酸组在肾组织中α1A-AR mRNA的表达有所逆转（p < 0.05）,除肺组织外,其他各组织中α1B-AR mRNA表达都有明显逆转（p < 0.05）,动脉、肝脏、肺脏、肾脏组织中α1D-AR mRNA表达明显逆转（p < 0.05）。结论细菌内毒素性休克时机体各主要脏器α1-肾上腺素受体基因表达普遍下调。抗氧化剂不同程度逆转细菌内毒素性休克时α1-肾上腺素受体基因表达可能是其改善循环机能障碍的机制之一。第二章一氧化氮及衍生物导致血管平滑肌细胞α1-肾上腺素受体基因表达下调目的观察炎症反应时血管平滑肌α1-肾上腺素受体基因转录水平的改变及可能机理。方法原代培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）,并作如下分组:（1）对照组（含10% FBS的DMEM培养液）;（2）酪氨酸组（Tyr,250μmol/L）;（3） 3-硝基酪氨酸组（3-NT, 250μmol/L）;（4）硝普钠组（SNP, 500μmol/L）;（5）炎性细胞因子组（cytokines,TNF-α100 ng/ml + IL-1β50 ng/ml）;（6） Nω-nitro-L-arginine methyl ester +炎性细胞因子组（L-NAME,L-NAME 5 mmol/L + TNF-α100ng/ml+IL-1β50 ng/ml）;（7） N-乙酰-5-甲氧基色胺+炎性细胞因子组（MLT,MLT 1 mmol/L + TNF-α100 ng/ml + IL-1β50 ng/ml）,每组重复六次。上述各组细胞干预12 h后,提取各组细胞的总RNA,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法测定α1A-AR、α1B-AR、α1D-AR mRNA的表达。结果与对照组相比,SNP组和Cytokines组血管平滑肌细胞细胞α1A-AR、α1D-AR mRNA的表达显著下降（P < 0.05）。L-NAME组、MLT组上述各受体亚型mRNA的表达比Cytokines组显著升高（P < 0.01）。与对照组相比,SNP组、3-NT组α1B-AR、α1D-AR mRNA表达明显降低（P < 0.05）。Tyr组α1-ARs三个亚型mRNA的表达与对照组比较无显著差异（P > 0.05）。结论一氧化氮（NO）及NO衍生物3-NT均显著抑制了血管平滑肌细胞细胞α1-肾上腺素受体mRNA的表达,可能为感染性休克时血管低反应性的病理机制之一。抑制NO的产生和抗氧化剂治疗可减轻这种病理反应。第三章抗氧化剂抑制细菌内毒素性休克大鼠诱导型一氧化氮合酶的基因表达目的观察抗氧化剂对细菌内毒素性休克时大鼠各组织器官诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响,探讨抗氧化剂逆转感染性休克循环机能障碍的机理。方法雄性SD大鼠40只,体重200-250 g,随机分成五组:①空白对照组（n = 8）;②细菌内毒素性休克组(LPS,15 mg·kg-1静脉注射,n = 8);③丙泊酚组(LPS注入1 h后,丙泊酚10 mg·kg-1静脉注射,继以10 mg·kg-1·h-1静脉持续泵入,n = 8);④尿酸组(UA,LPS注入1h后,腹腔注射UA 200 mg·kg-1,n = 8);⑤N-乙酰5-甲氧基色胺组(MLT,LPS注入1 h后,腹腔注射MLT 10 mg·kg-1,n = 8)。各组大鼠于注射LPS 6 h后处死,迅速留取胸主动脉、下腔静脉、心脏、肝脏、肺脏、肾脏组织。提取各组织的总RNA,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组织内iNOS mRNA的表达。注射LPS 6 h后检测各组动物血浆丙二醛（MDA）及硝酸盐/亚硝酸盐（nitrate/nitrite）的浓度。结果与对照组比较,LPS组各组织器官的iNOS mRNA表达均大幅度上升（p < 0.01）。与LPS组相比较,丙泊酚组动脉iNOS mRNA表达下降26%（P < 0.05）,其他组织器官iNOS mRNA表达下降更为显著（P < 0.01）,其中静脉组织表达下调最为显著达44.7%。UA组各组织器官iNOS mRNA表达均显著下调（P < 0.01）,其中静脉iNOS mRNA的表达较之LPS组下调56.6%。MLT组各组织器官iNOS mRNA表达与LPS组相比也显著降低（P < 0.05）。各药物治疗组血浆MDA和nitrate/nitrite的浓度也明显低于LPS组（p < 0.05）。结论感染性休克大鼠循环机能障碍与细菌内毒素和炎症介质刺激iNOS mRNA过度表达,大量NO产生相关。抗氧化剂通过抑制iNOS mRNA过度表达和减少体内过氧化物的形成,是改善改善感染性休克循环机能障碍的另一可能机制。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

绪言

文献综述

1. ARs 在心血管中的分布、信号转导机制与介导的效应

1.1 α_1-肾上腺素受体

1.2 α_2-肾上腺素受体

1.3 β-肾上腺素受体

2. 感染性休克时 AR 的变化及可能机制

2.1 α_1-肾上腺素受体

2.2 α_2-肾上腺素受体

2.3 β-肾上腺素受体

3.结束语

第一章 抗氧化剂有效抑制细菌内毒素性休克大鼠α_1-肾上腺素受体基因表达下调

材料和方法

1.材料

1.1 实验动物

1.2 主要仪器设备

1.3 主要试剂

1.4 主要试剂配制

2.实验方法

2.1 制备感染性休克大鼠模型

2.2 实验动物分组及标本采集与准备

2.3 组织总RNA提取:

2.3.1 总RNA提取过程

2.3.2 RNA 的完整性检测:采用水平式琼脂糖凝胶电泳

2.4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

2.4.1 逆转录(20 μl 反应体系)

2.4.2 PCR 引物

2.4.3 引物的配制

2.4.4 聚合酶链反应(PCR)

2.4.5 PCR产物电泳—

2.4.6 PCR 产物测序

3.数据处理和统计学分析

结 果

1.RNA 完整性检测

2.各组大鼠α_1-ARs mRNA的表达状

3.感染性休克时大鼠α_1-ARs mRNA的表达状况

4.抗氧化剂治疗感染性休克后大鼠α_1-ARs mRNA的表达状况

5 PCR 产物测序

讨 论

第二章 一氧化氮及其衍生物导致血管平滑肌细胞α_1-肾上腺素受体基因表达下调

材料和方法

1 材料

1.1 主要仪器设备

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂配制

1.3.1 高糖 DMEM 培养基

1.3.2 新生小牛血清

1.3.3 Hanks 液

1.3.4 D-Hanks 液:

1.3.5 PBS 溶液:

1.3.6 胰蛋白酶(1:125):

1.3.7 0.5 mg/ml 多聚赖氨酸

1.3.8 0.1%DEPC 水(无 Rnase 水)

1.3.9 5×TBE 缓冲液

1.3.10 6×上样缓冲液:

2 实验方法

2.1 大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)的培养

2.1.1 生长基质包被培养瓶

2.1.2 组织块帖壁法大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的原代培养

2.2 对平滑肌细胞的干预

2.3 总 RNA 提取

2.3.1 总RNA提取过程

2.3.2 RNA 的完整性检测

2.4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR):

3 数据处理和统计学分析

结 果

1 血管平滑肌细胞的鉴定

1.1 光镜下所见

1.2 电镜下所见

2. 各组大鼠血管平滑肌细胞α1-ARs mRNA的表达

2.1 正常对照组

2.2 炎性细胞因子组

2.3 L-NAME 组

2.4 MLT 组

2.5 SNP 组

2.6 Tyr 组

2.7 3-NT 组

讨 论

第三章 抗氧化剂抑制细菌内毒素性休克大鼠诱导型一氧化氮合酶的基因表达

材料和方法

1. 材料

1.1 实验动物

1.2 主要仪器设备

1.3 主要试剂

1.4 主要试剂配制

1.4.1 3%苦味酸

1.4.2 2%戊巴比妥钠

1.4.3 0.1%DEPC 水(无 Rnase 水)

1.4.4 10×TBE 缓冲浓缩液

1.4.5 6×上样缓冲液

1.4.6 50 %冰醋酸

2. 实验方法

2.1 制备感染性休克大鼠模型

2.2 实验动物分组及标本采集与准备

2.2.1 实验动物分组同第一章。

2.2.2 标本采集与准备:

2.2.3 组织总RNA提取

2.2.4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

2.2.5 血浆丙二醛(MDA)浓度检测

2.3 血浆 NO 浓度测定

2.3.1 NO 检测试剂盒:

2.3.2 原理:

2.3.3 试剂盒组成:

2.3.4 检测步骤

2.3.5 计算公式:

3 数据处理和统计学分析

结 果

1.正常大鼠 iNOS mRNA 的表达状况

2.感染性休克时大鼠 iNOS mRNA 的表达状况

3.抗氧化剂治疗感染性休克后大鼠 iNOS mRNA 的表达的影响

4.各组大鼠血浆 MDA 和 NO 的浓度

5.PCR产物测序

讨 论

结论

参考文献

致谢

发布时间: 2007-06-11

参考文献

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• [5].金纳米抗氧化剂的构建及活性研究[D]. 张悦.吉林大学2016
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• [7].探讨抗氧化剂对人血管内皮细胞炎症反应的干预作用[D]. 李榜龙.南华大学2010
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