生物法合成培南类药物中间体(R-（-）-1,3-丁二醇的研究

论文摘要

(R)-（-）-1,3-丁二醇（1,3-BDO）是一种重要的手性合成子,广泛用于碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮、香料、信息激素和杀虫剂的合成。因此,开发绿色、高效的（R）-1,3-丁二醇合成技术引起了国内外学术、工业界的广泛关注。以潜手性的醛或酮等羰基化合物为底物,通过氧化还原酶不对称还原是制备手性醇的重要方法。本文首先建立了底物4-羟基-2-丁酮和产物1,3-丁二醇的气相分析方法,并成功实现了 2种异构体在手性色谱柱上的基线分离。从200余份土样中筛选到一株能够高效催化4-羟基-2-丁酮合成（R）-1,3-丁二醇的菌株ZJB-09162,产物光学纯度达99%以上。通过形态学、生理生化试验、18SrDNA序列和系统发育分析,确定该菌株为克鲁斯假丝酵母（Candidakrusei）。通过单因素实验优化了C.krusei ZJB-09162产羰基还原酶的培养基成分,确定了最适培养基组成为（g/L）:葡萄糖50.0,酵母膏50.0,（NH4）2HP04 2.5,KH2P04 2.5,NaCl1.0。同时也确定了最适的发酵产酶条件为:初始pH 6.0,装液量12%,接种量4%。在上述培养条件下,30℃、150rpm培养60h后,菌体干重达15.2g/L,羰基还原酶活力达到120 U/L。进一步考察了静息细胞不对称还原过程中缓冲液pH、温度、辅助底物、底物浓度等参数的影响,得到了最适反应条件:温度35℃,缓冲液Tris-HCl,pH8.5,辅助底物葡萄糖8%（w/v）。当底物4-羟基-2-丁酮浓度为400 mM时,生物转化36 h,产物e.e.值和浓度分别达到99%和210mM。以上结果表明,C.krusei ZJB-09162在生物合成（R）-（-）-1,3-丁二醇中具有很好的工业化应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 手性药物
• 1.2 手性药物的合成方法
• 1.2.1 手性源法
• 1.2.2 外消旋体拆分法
• 1.2.2.1 物理拆分法
• 1.2.2.2 化学拆分法
• 1.2.2.3 生物拆分法
• 1.2.3 不对称合成法
• 1.2.3.1 化学法羰基不对称还原
• 1.2.3.2 生物法羰基不对称还原
• 1.3 手性药物中间体——（R）-（-）-1,3-丁二醇
• 1.3.1 （R）-1,3-丁二醇的合成方法
• 1.3.1.1 化学合成法
• 1.3.1.2 生物催化法
• 1.4 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 羰基还原酶产生菌的筛选与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 菌种筛选
• 2.2.1 土样
• 2.2.2 化学试剂与主要仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.3.1 富集培养基
• 2.2.3.2 斜面培养基
• 2.2.3.3 种子培养基
• 2.2.3.4 发酵培养基
• 2.2.4 菌种筛选过程
• 2.2.4.1 菌体的培养
• 2.2.4.2 菌体的转化
• 2.2.4.3 反应产物光学纯度及产率的测定
• 2.2.5 菌种鉴定
• 2.2.5.1 菌株形态学研究
• 2.2.5.2 生理生化鉴定
• 2.2.5.3 18S rDNA的扩增
• 2.2.5.4 系统发育学分析
• 2.2.5.5 假菌丝的观察
• 2.2.6 羰基还原酶粗酶的制备
• 2.2.7 菌株ZJB-09162羰基还原酶粗酶辅酶依赖型的确定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 产物鉴定
• 2.3.1.1 产物GC-MS分析
• 2.3.1.2 1,3-丁二醇的手性分析
• 2.3.1.3 产物构型分析
• 2.3.2 菌株ZJB-09162的鉴定
• 2.3.2.1 形态学观察
• 2.3.2.2 生理生化鉴定
• 2.3.2.3 18S rDNA序列测序结果分析
• 2.3.2.4 假菌丝的观察
• 2.3.3 C.krusei ZJB-09162羰基还原酶粗酶的辅酶依赖型
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 C.KRUSEI ZJB-09162羧基还原酶产酶条件的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 菌体培养
• 3.2.4 生物量测定
• 3.2.5 羰基还原酶酶活的测定
• 3.2.5.1 羰基还原酶酶活的定义
• 3.2.5.2 羰基还原酶酶活的测定方法
• 3.2.6 气相色谱分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基组分的优化
• 3.3.1.1 发酵培养基碳源的选择及浓度的确定
• 3.3.1.2 氮源的选择及浓度的确定
• 3.3.1.3 磷源的选择
• 3.3.1.4 金属离子的选择
• 3.3.1.5 添加不同种类氨基酸对菌株生长及酶活的影响
• 3.3.1.6 不同挡板对菌株生长及酶活的影响
• 3.3.1.7 培养基中添加不同浓度的底物和产物对菌株生长及酶活的影响
• 3.3.2 不同培养条件的优化
• 3.3.2.1 培养基初始pH的确定
• 3.3.2.2 培养基装液量
• 3.3.2.3 培养基接种量
• 3.3.3 C.krusei ZJB-09 162生长及发酵产酶过程
• 3.3.4 C.krusei ZJB-09162不对称还原4-羟基-2-丁酮合成（R）-1,3-丁二醇
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 C.KRUSEI ZJB-09162全细胞不对称催化体系反应条件的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 菌体培养
• 4.2.4 反应产率的测定
• 4.2.5 气相色谱分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 反应体系pH的选择
• 4.3.2 反应体系温度的选择
• 4.3.3 不同辅助底物对反应的影响
• 4.3.4 辅助底物的浓度对不对称还原反应的影响
• 4.3.5 不同底物浓度对不对称还原反应的影响
• 4.3.6 相同S/C下不同底物浓度对不对称还原反应的影响
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 致谢
• 附录