光合细菌（球形红假单胞菌）发酵产辅酶Q10的研究

论文摘要

微生物发酵法生产辅酶Q10是最有潜力实现工业化的生产方法,辅酶Q10的医疗价值和保健功能不断得到应用,光合细菌富含辅酶Q10,因此本论文以球形红假单胞菌（R. sphaeroides ）1.1737T为出发菌株,通过紫外和化学复合诱变,先筛选出抗罗红霉素突变株,然后以该突变株为出发菌株,筛选得到耐对羟基苯甲酸的突变株PHBr-2,其辅酶Q10产量可达50.60mg/L。突变株PHBr-2连续传代5次后,其辅酶Q10的产量为49.5mg/L,比原始菌株R. sphaeroides R1（16.37mg/L）提高了202.38%。证明经紫外诱变和亚硝基胍复合诱变获得的突变株PHBr-2的性状能稳定遗传。采用紫外分光光度法测定辅酶Q10含量,确定以碱皂化法提取辅酶Q10,并对碱皂化法进行优化,得到了碱皂化法的工艺为:菌悬液离心并洗涤菌体,在湿菌体中加入5mL丙酮,冰浴条件下超声波破碎并移入圆底烧瓶中,加入pH 3.0的酸性水10mL,搅拌均匀,90℃下回流1h,缓慢加入10% NaOH 15mL混匀,90℃回流1h,迅速冷却,加入25mL正己烷提取2次,合并萃取液,去离子水洗至中性,以无水硫酸钠脱水至澄清,真空旋转蒸发浓缩,再用10mL无水乙醇溶解,即得辅酶Q10的抽提液。研究Mg2+、Fe2+、Mn2+的不同浓度对辅酶Q10产量的影响,表明其对辅酶Q10的生产起促进作用。通过正交实验法确定了最优的发酵培养基为（g/L）:无水乙酸钠1,柠檬酸钠2,蛋白胨3,酵母膏3,硫酸铵7,磷酸二氢钾3,硫酸镁1,氯化钠2,碳酸氢钠1,加入微量元素溶液、维生素溶液各1mL。最佳培养条件为:培养基初始pH值6.5、温度30℃、光强3000Lx、接种量4%。经过培养基及培养条件优化后,菌株PHBr-2的辅酶Q10产量可达74.4mg/L,比优化前（49.5mg/L）提高了50.30%。用硅胶柱层析法对辅酶Q10粗提液进行分离纯化。比较了不同孔径分布的200-300目与80-120目粗孔Ⅱ号硅胶的分离效果,确定采用80-120目粗孔Ⅱ号硅胶为固定相,以正己烷/无水乙醇（V/V=8:2）为流动相洗脱,经过无水乙醇结晶纯化,辅酶Q10粗提液的提纯率为77.08%。通过对该菌不同培养模式的初步探索,将接种后的发酵培养基在30℃、150r/min摇床培养24h后,将其放置在光照强度为3000Lx的培养箱里静置培养,比接种后直接光照静置培养,其辅酶Q10产量由74.4mg/L提高到78.36mg/L,通过观察溶氧、pH值在发酵过程中的变化,得出溶氧是辅酶Q10发酵中的重要因素,因此今后可通过探讨不同的培养模式及溶氧水平的控制提高辅酶Q10的产量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 10 概述'>1.1 辅酶Q₁₀概述
• 10 的性质与结构'>1.1.1 辅酶Q₁₀的性质与结构
• 10 在人体中的分布'>1.1.2 辅酶Q₁₀在人体中的分布
• 10 的应用'>1.1.3 辅酶Q₁₀的应用
• 10 的测定方法'>1.2 辅酶Q₁₀的测定方法
• 10 的定性测定'>1.2.1 辅酶Q₁₀的定性测定
• 10 的定量测定'>1.2.2 辅酶Q₁₀的定量测定
• 10 的生产方法'>1.3 辅酶Q₁₀的生产方法
• 10 生产方法概述'>1.3.1 辅酶Q₁₀生产方法概述
• 1.3.2 微生物发酵法
• 10 的研究进展'>1.4 微生物发酵法生产辅酶Q₁₀的研究进展
• 1.4.1 菌种的选择
• 10 的生物合成路线'>1.4.2 辅酶Q₁₀的生物合成路线
• 1.4.3 菌种的遗传改造
• 1.4.4 微生物发酵法的手段
• 1.5 论文立题背景及主要研究内容
• 10 提取测定方法的确定'>2 辅酶Q₁₀提取测定方法的确定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 10 的鉴定'>2.3.1 辅酶Q₁₀的鉴定
• 2.3.2 破碎率的检测方法
• 10 提取方法'>2.3.3 辅酶Q₁₀提取方法
• 2.3.4 碱皂化法提取工艺的确定
• 10 含量'>2.3.5 紫外分光光度法测定辅酶Q₁₀含量
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 酪蛋白标准曲线的制作
• 2.4.2 细胞破碎次数的确定
• 10 标准曲线的制作'>2.4.3 辅酶Q₁₀标准曲线的制作
• 10 扫描曲线'>2.4.4 辅酶Q₁₀扫描曲线
• 2.4.5 碱皂化法提取工艺的确定
• 2.5 本章小结
• 3 球形红假单胞菌的培养及复合诱变选育
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌株培养方法
• 3.3.2 生物量的测定
• 3.3.3 种子培养基的正交实验优化
• 3.3.4 诱变选育
• 3.3.5 初筛方法的探讨
• 10 的提取'>3.3.6 辅酶Q₁₀的提取
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 球形红假单胞菌的培养
• 3.4.2 好氧培养基的优化
• 3.4.3 菌的诱变选育
• 3.5 本章小结
• 4 诱变后菌株发酵条件的优化
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 发酵培养基的优化
• 4.3.2 发酵培养条件的优化
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 发酵培养基的优化
• 4.4.2 发酵条件的优化
• 10 的发酵过程'>4.4.3 球形红假单胞菌PHBr-2 产辅酶Q₁₀的发酵过程
• 10 发酵的影响'>4.4.4 不同培养模式对辅酶Q₁₀发酵的影响
• 4.5 本章小结
• 10 的分离纯化'>5 辅酶Q₁₀的分离纯化
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 实验菌株
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 主要试剂
• 5.2.4 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 10 的提取'>5.3.1 辅酶Q₁₀的提取
• 10 的纯化'>5.3.2 辅酶Q₁₀的纯化
• 5.3.3 结晶纯化
• 10 收率的计算'>5.3.4 辅酶Q₁₀收率的计算
• 10 的检测'>5.3.5 辅酶Q₁₀的检测
• 5.4 结果与分析
• 10 提纯率的影响'>5.4.1 不同浓度的洗脱液对辅酶Q₁₀提纯率的影响
• 10 粗提液的分离'>5.4.2 硅胶柱对辅酶Q₁₀粗提液的分离
• 10 扫描曲线图'>5.4.3 辅酶Q₁₀扫描曲线图
• 5.4.4 不同目数的硅胶分离效果的比较
• 5.5 本章小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 发表的学术论文